Qdot-लेबल प्रोटीन और साइट के बीच बातचीत visualizing-विशेष रूप से संशोधित λ डीएनए एकल अणु स्तर पर
Summary
यहां, हम एक साइट का उपयोग कर कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) द्वारा डीएनए-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-विशेष रूप से संशोधित λ डीएनए सब्सट्रेट और एक क्वांटम-डॉट लेबल प्रोटीन.
Abstract
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ने एकल अणु स्तर पर जटिल जैविक प्रक्रियाओं के तंत्र को विदारक करने में बड़ा योगदान दिया है. डीएनए का अध्ययन करने के लिए एक अणु परख में प्रोटीन बातचीत, वहां विचार के लिए दो महत्वपूर्ण कारक हैं: आसान अवलोकन के लिए पर्याप्त लंबाई के साथ डीएनए सब्सट्रेट और एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट जांच के साथ एक प्रोटीन लेबल । ४८.५ kb λ डीएनए सब्सट्रेट के लिए एक अच्छा उंमीदवार है । क्वांटम डॉट्स (Qdots), फ्लोरोसेंट जांच के एक वर्ग के रूप में, लंबे समय तक अवलोकन (घंटे के लिए मिनट) और उच्च गुणवत्ता छवि अधिग्रहण की अनुमति देते हैं । इस पत्र में, हम डीएनए का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित एकल-अणु स्तर पर प्रोटीन बातचीत, जो एक साइट की तैयारी भी शामिल है-विशेष रूप से संशोधित λ डीएनए और लेबलिंग streptavidin-लेपित Qdots के साथ एक लक्ष्य प्रोटीन । अवधारणा का एक सबूत के लिए, हम ORC का चयन (मूल मांयता परिसर) में रुचि के एक प्रोटीन के रूप में नवोदित खमीर और एक ARS (autonomously नकल अनुक्रम) TIRFM का उपयोग कर के साथ अपनी बातचीत कल्पना । अंय फ्लोरोसेंट जांच के साथ तुलना में, Qdots एक अणु photobleaching के खिलाफ उच्च स्थिरता के कारण अध्ययन में स्पष्ट लाभ है, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस संपत्ति मात्रात्मक परख में अपने आवेदन सीमा ।
Introduction
प्रोटीन और डीएनए के बीच बातचीत ऐसे डीएनए प्रतिकृति के रूप में कई जटिल जैविक प्रक्रियाओं, के लिए आवश्यक हैं, डीएनए की मरंमत, और प्रतिलेखन । हालांकि पारंपरिक दृष्टिकोण इन प्रक्रियाओं के गुणों पर प्रकाश डाला है, कई प्रमुख तंत्र अभी भी अस्पष्ट हैं । हाल ही में, तेजी से एक अणु तकनीक के विकास के साथ, तंत्र के कुछ1,2,3को संबोधित किया गया है ।
प्रोटीन visualizing पर एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के आवेदन-वास्तविक समय में डीएनए बातचीत मुख्य रूप से प्रतिदीप्ति का पता लगाने और फ्लोरोसेंट जांच के विकास पर निर्भर करता है । एक एकल अणु अध्ययन के लिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट जांच के साथ ब्याज की प्रोटीन लेबल प्रतिदीप्ति का पता लगाने प्रणालियों ज्यादातर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ।
फ्लोरोसेंट प्रोटीन सामांयतः आणविक जीवविज्ञान में उपयोग किया जाता है । हालांकि, कम फ्लोरोसेंट चमक और photobleaching के खिलाफ स्थिरता कई एकल अणु परख में अपने आवेदन को सीमित । क्वांटम डॉट्स (Qdots) छोटे प्रकाश उत्सर्जक नैनोकणों4। उनके अद्वितीय ऑप्टिकल संपत्तियों के कारण, Qdots 10-20 बार उज्जवल और कई हजार बार व्यापक रूप से इस्तेमाल किया कार्बनिक रंजक5से अधिक स्थिर हैं । इसके अलावा, Qdots एक बड़े स्टोक्स बदलाव (उत्तेजना और उत्सर्जन चोटियों की स्थिति के बीच अंतर)5है । इस प्रकार, Qdots लंबे समय तक अवलोकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (घंटे के लिए मिनट) और उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात के साथ छवियों का अधिग्रहण, जबकि वे मात्रात्मक परख में उपयोग नहीं किया जा सकता.
तारीख करने के लिए, वहाँ दो दृष्टिकोण Qdots साइट के साथ एक लक्ष्य प्रोटीन लेबल करने के लिए कर रहे हैं-विशेष रूप से: Qdot की सहायता से लेबलिंग-संयुग्मित प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी6,7,8; या सीधे Qdots के साथ लक्ष्य प्रोटीन लेबलिंग, जो बायोटिन और streptavidin9,10,11,12,13के बीच मजबूत बातचीत पर आधारित है । Streptavidin-लेपित Qdots व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । हमारे हाल के अध्ययन में, साइट-विशेष रूप से उच्च दक्षता के साथ नवोदित खमीर में biotinylated प्रोटीन बिरा के सह-व्यक्त और Avi-10 vivo मेंप्रोटीन टैग द्वारा शुद्ध थे । निंनलिखित और एकल अणु14,15,16,17के अनुकूलन के द्वारा, हम Qdot के बीच बातचीत मनाया प्रोटीन और डीएनए एकल अणु स्तर पर लेबल का उपयोग TIRFM10.
यहां, हम नवोदित खमीर मूल मांयता परिसर (ORC) है, जो विशेष रूप से पहचान और autonomously नकल अनुक्रम (ARS) के लिए बाध्य कर सकते हैं, हमारे हित के प्रोटीन के रूप में चुनें । निंनलिखित प्रोटोकॉल TIRFM का उपयोग ARS के साथ Qdot-लेबल ORC की बातचीत visualizing के एक कदम दर कदम प्रक्रिया प्रस्तुत करता है । साइट की तैयारी-विशेष रूप से संशोधित डीएनए सब्सट्रेट, डीएनए biotinylation, द coverslip क्लीनिंग एण्ड functionalization, फ्लो-सेल असेंबली, और सिंगल-अणु इमेजिंग बताई गई हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम एक प्रोटोकॉल मौजूद Qdot-लेबल प्रोटीन और साइट के बीच बातचीत का निरीक्षण करने के लिए विशेष रूप से संशोधित λ डीएनए एक प्रवाह में TIRFM का उपयोग कर-सेल । आवश्यक कदम साइट-डीएनए सब्सट्रेट, डीएनए biotinylation, coverslip सफ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ हसन Yardimci और डॉ Sevim Yardimci फ्रांसिस क्रिकेटरों संस्थान के एकल अणु प्रयोगों में मदद करने के लिए धंयवाद, डॉ डैनियल Duzdevich कोलंबिया विश्वविद्यालय के डॉ एरिक सी ग्रीन लैब से, डॉ Yujie पेकिंग विश्वविद्यालय के सन और डॉ चुनलाई चेन के… उपयोगी चर्चा के लिए Tsinghua विश्वविद्यालय । इस अध्ययन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था चीन ३१३७१२६४, ३१४०१०५९, कैस अनुशासनात्मक नवाचार टीम और ंयूटन उंनत फैलोशिप (NA140085) रॉयल सोसायटी से ।
Materials
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25×36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25×36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
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