Visualisera samspelet mellan Qdot-märkt Protein och anläggningsvis modifierade λ DNA på nivån enda molekyl
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att studera DNA-protein interaktioner av totalreflexion fluorescensmikroskopi (TIRFM) med hjälp av ett anläggningsvis modifierade λ DNA-substrat och en Quantum-dot märkt protein.
Abstract
Fluorescensmikroskopi har gjort stora bidrag i dissekera mekanismerna av komplexa biologiska processer på nivån enda molekyl. I enda molekyl analyser för att studera DNA-protein interaktioner, det finns två viktiga faktorer för övervägande: DNA underlaget med tillräcklig längd för enkel observation och märkning ett protein med en lämplig fluorescerande sond. 48,5 kb λ DNA är en bra kandidat för DNA substratet. Kvantprickar (Qdots), tillåta som en klass av fluorescerande sonder, long-time observation (minuter till timmar) och högkvalitativ bild förvärv. I detta papper presentera vi ett protokoll för att studera DNA-protein interaktioner på singel-molekyl nivå, vilket inkluderar förbereder en anläggningsvis modifierade λ DNA och märkning ett målprotein med streptividin-belagd Qdots. För ett proof of concept, vi väljer ORC (ursprung erkännande komplexa) i spirande jäst som ett protein av intresse och visualisera dess interaktion med en ARS (autonomt replikerande sekvens) med hjälp TIRFM. Jämfört med övriga fluorescerande sonder, Qdots har uppenbara fördelar i enda molekyl studier på grund av dess höga stabilitet mot fotoblekning, men det bör noteras att detta boende begränsar dess tillämpning i kvantitativa analyser.
Introduction
Interaktioner mellan protein och DNA är nödvändiga för många komplexa biologiska processer, såsom DNA-replikation, DNA-reparation och transkription. Även konventionella metoder har belyst egenskaperna för dessa processer, är många viktiga mekanismer fortfarande oklart. Nyligen, med de snabbt växande enda molekyl teknikerna, vissa mekanismer har varit adresserade1,2,3.
Tillämpningen av singel-molekyl fluorescensmikroskopi på visualisera protein-DNA-interaktion i realtid huvudsakligen beror på utvecklingen av fluorescens upptäckt och fluorescerande sonder. För en enda molekyl studie är det viktigt att märka proteinet av ränta med en lämplig fluorescerande sond eftersom fluorescens detektionssystem finns mestadels kommersiellt.
Fluorescerande proteiner används ofta i molekylärbiologi. Men begränsar låg fluorescerande ljusstyrka och stabilitet mot fotoblekning dess tillämpning i många enda molekyl analyser. Kvantprickar (Qdots) är små ljusavgivande nanopartiklar4. På grund av deras unika optiska egenskaper, Qdots är 10 – 20 gånger ljusare och flera tusen gånger mer stabil än den utbredda organiska färgämnen5. Dessutom har Qdots en stor Stokes Skift (skillnaden mellan excitation och utsläpp toppar ställning)5. Qdots kan således användas för lång tid observation (minuter till timmar) och förvärvet av bilder med hög signal-brus-förhållanden, medan de inte kan utnyttjas i de kvantitativa analyserna.
I dag finns det två tillvägagångssätt att märka ett målprotein med Qdots anläggningsvis: märkning med hjälp av Qdot-konjugerad primära eller sekundära antikroppar6,7,8. eller märkning målproteinet med Qdots direkt, som är baserad på den starka växelverkan mellan biotin och streptividin9,10,11,12,13. Streptividin-belagda Qdots är kommersiellt tillgängliga. I vår senaste studie, anläggningsvis biotinylerade proteiner i spirande jäst med hög verkningsgrad var renas genom co-överuttryck av BirA och Avi-märkta proteiner i vivo10. Genom följande och optimera den enda-molekyl analyser14,15,16,17, observerade vi interaktioner mellan Qdot-märkta proteiner och DNA på den enda molekyl nivå med TIRFM10.
Här kan vi välja spirande jäst ursprung-erkännande komplexa (ORC), som kan specifikt känna igen och binda till självständigt replikerande sekvensen (ARS), som våra protein av intresse. Följande protokoll presenterar ett stegvis förfarande att visualisera samspelet mellan Qdot-märkt ORC med ARS med TIRFM. Beredning av anläggningsvis modifierad DNA substratet, den DNA-biotinylation, täckglas rengöring och funktionalisering, flöde-cell församlingen och singel-molekyl bildtagning beskrivs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll för att observera samspelet mellan Qdot-märkt proteinet och anläggningsvis modifierade λ DNA med TIRFM i ett flöde-cell. Nödvändiga åtgärder inkluderar platsspecifika modifiering av DNA substrat, DNA biotinylation, täckglas rengöring och funktionalisering, flöde-cell förberedelse och singel-molekyl imaging. Det finns två viktiga punkter som bör noteras. Först, alla de olika stegen med λ DNA bör manipuleras försiktigt för att minska eventuella skador, t.ex., a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Hasan Yardimci och Dr.Sevim Yardimci av Francis Crick Institute for typ hjälpa i singel-molekyl experiment, Dr. Daniel Duzdevich från Dr. Eric C. Greenes lab av Columbia University, Dr Yujie Sun av Pekings universitet och Dr. Chunlai Chen av Tsinghua University för nyttig diskussion. Denna studie stöddes av den naturliga vetenskapen Foundation Kinas nationella 31371264, 31401059, CAS tvärvetenskapliga Innovation Team och Newton avancerade gemenskap (NA140085) från Royal Society.
Materials
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25×36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25×36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of transcriptional bursting in bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
