Le test de fixation du Lactate déshydrogénase — Une méthode Simple et fiable pour déterminer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères
Summary
Un protocole simple et bien validé pour mesurer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères est décrit ici. La méthode est basée sur la quantification de la proportion de la lactate déshydrogénase (LDH) dans les fractions de cellules sédimentables par rapport aux niveaux LDH cellulaires totales.
Abstract
En vrac autophagie est caractérisée par la séquestration de larges portions du cytoplasme en double/multi-membrane structures appelées autophagosomes. Un protocole simple de contrôler ce processus est décrit ici. En outre, les résultats typiques et validation expérimentale de la méthode dans des conditions inductrices d’autophagie dans divers types de cellules mammifères cultivées sont fournis. Au cours de l’autophagie en vrac, autophagosomes séquestrer le cytosol et aussi des protéines cytosoliques solubles, aux côtés d’autres cargaisons autophagie. LDH est stable et très abondant, soluble enzyme cytosolique qui est non sélective séquestré dans autophagosomes. Le montant de la séquestration du LDH reflète donc la quantité de séquestration autophagique en vrac. Pour efficacement et précisément déterminer la séquestration de LDH dans les cellules, nous utilisons un protocole basé sur electrodisruption de fractionnement qui sépare efficacement sédimentables LDH cytosolique, suivie de la mesure de l’activité enzymatique dans sédimentables fractions par rapport à des échantillons de cellules entières. Séquestration de l’autophagie est déterminée en soustrayant la proportion de sédimentables LDH dans les cellules non traitées que dans les cellules traitées. L’avantage de l’essai de séquestration de LDH est qu’il donne une mesure quantitative de la séquestration autophagique du fret endogène, par opposition à d’autres méthodes que soit impliquent l’expression ectopique de sondes de séquestration ou semi-quantitatifs protéase analyses de la protection des récepteurs ou des marqueurs de l’autophagie.
Introduction
Autophagie (du grec « se manger ») est un processus évolutif et conservé pour dégradation lysosomale/vacuolaire du matériel intracellulaire. Lors de la découverte des gènes liés autophagie (« ATG »), qui sont importants pour l’autophagie chez les levures et les humains, et la réalisation que l’autophagie joue un rôle important dans la santé humaine et de la maladie (reconnu par le prix Nobel de médecine ou de physiologie à 2016 Yoshinori Ohsumi), autophagie est rapidement devenu un des procédés plus intensément étudiés en cellule biologie1,2.
Macroautophagy (ci-après dénommé « autophagie ») est caractérisée par l’expansion et pliage de saccules membranaires intracellulaire (« phagophores ») dans des structures scellées, double – ou multi – membrane (« autophagosomes ») séquestrent efficacement le enveloppé de matériel du reste du cytoplasme. Lors de la fusion des autophagosomes avec les lysosomes, la membrane intérieure autophagosomal et la cargaison séquestrée est dégradée et recyclés. Autophagosomes peut piéger le matériel cytoplasmique en aléatoire (autophagie non sélectif) et manières sélectives (autophagie sélective). En vrac autophagie probablement représente un mélange de l’autophagie non-sélective et sélective.
Dans les années 60 et 70 (« l’ère morphologique » de la recherche de l’autophagie), séquestration autophagique a été principalement évaluée au moyen d’analyses ultrastructurales. Dans les années 1980 et au début des années 1990 (« l’ère biochimique ») par Seglen et collègues de travail — qui a étudié l’autophagie dans les hépatocytes primaires de rat — mis au point les premières méthodes pour mesurer quantitativement la séquestration autophagique activité3. À l’aide de ces tests, Seglen défini et caractérise les différentes étapes de la voie autophagique lysosomal4,5, découvert et a inventé l’amphisome6 (le produit de la fusion de l’endosome-autophagosome) et fut le premier à décrire le rôle de la phosphorylation des protéines l’autophagie règlement7. Cependant, après la découverte des ATGs dans les années 1990 (« l’ère moléculaire ») et la première caractérisation d’une protéine ATG8 chez les mammifères, les protéines associées aux microtubules 1 a/1 b-light chain 3 (LC3) 20008, l’utilisation de protéines ATG comme marqueurs pour la processus autophagique rapidement gagné en popularité, et les plus âgés et plus laborieux des méthodes biochimiques ont été laissés. En fait, sur les 18 dernières années, les tache occidentale et les analyses de microscopie de fluorescence de LC3 sont devenues de loin la plus populaire (et dans bien des cas la seule) moyens d’étudier l’autophagie des cellules de mammifères. L’avantage est la facilité par laquelle ces méthodes peuvent être effectuées. L’inconvénient est que l’on étudie un composant du panier (LC3) plutôt que de réel autophagique fret. Il s’agit d’un inconvénient plutôt sérieux, parce que la relation entre les Etats et/ou les flux de LC3 par la voie contre la séquestration et de la cargaison n’est pas très claire. En fait, nous avons montré que le flux de cargaison en vrac peut être maintenue à des niveaux élevés dans des conditions où il n’y a aucun flux LC3, malgré la présence de LC3 conjugués dans les cellules9. En outre, nous avons démontré que l’autophagie en vrac n’est pas affectée par l’appauvrissement LC3 efficace et donc probablement est indépendant du LC39. Cette constatation est confirmée plus tard par LC3 études knock out10,11, qui indiquent également que mitophagy Parkin-dépendante (l’autophagie sélective des mitochondries) est indépendant de LC310,11 .
En résumé, il n’y a absolument besoin pour analyses fret surveiller l’activité de l’autophagie. Façon optimale ces tests devraient être largement applicable, bien définie et facile à exécuter. Au cours de ces dernières années, nous avons pris un intérêt particulier pour le test de fixation du LDH, qui a été développé par Seglen dans les années 198012et repose sur la mesure de la cession de LDH cytosolique à sédimentables, cellule de contenant des vacuoles autophagique fractions. LDH est une protéine cytosolique stable, soluble qui est séquestrée facilement conjointement au moment où phagophores enwrap fret cytoplasmique. Séquestration de LDH est donc une mesure générale de séquestration de l’autophagie. LDH est exclusivement dégradée par la voie autophagique lysosomal12. Ainsi, en présence d’inhibiteurs de dégradation lysosomale, par exemple, bafilomycine A1 (Baf)13, directement les effets du traitement expérimental reflètent altérations dans l’activité de séquestration autophagie. En l’absence d’inhibiteurs de la dégradation, l’effet net des altérations dans la séquestration de la LDH et de la dégradation peut être mesurée.
Le test de fixation du LDH est largement applicable, puisque la LDH s’exprime fortement et de façon ubiquitaire dans tous les types de cellules, et des niveaux LDH peuvent être quantifiées avec précision par un dosage enzymatique14,15. Toutefois, l’original du protocole12 — établi dans les hépatocytes primaires de rat — est plutôt fastidieux et requiert une grande quantité d’à partir de matériel comme un condensateur de décharge électrique sur mesure. De manière progressive, nous avons progressivement transformé l’essai dans une méthode simple et versatile. Tout d’abord, le protocole original a été adapté pour une utilisation dans des cellules de mammifères lignes16. Deuxièmement, la méthode a été substantiellement à échelle réduite de3,9. Troisièmement, plusieurs étapes dans le protocole ont été éliminés, y compris un coussin de densité laborieuse étape17. En même temps, cela a permis une réduction encore plus loin de la méthode, dans le point de départ original d’utiliser une plaque de 10 cm par exemple16 pour utiliser un seul puits d’une plaque de 12 puits par échantillon (soitenviron 15 fois moins à partir le matériel)17. Quatrièmement, nous avons identifié un appareil commercial électroporation qui pourrait remplacer le condensateur de décharge électrique sur mesure17.
Notre protocole à jour de l’essai de fixation du LDH, qui comprend quelques simplifications supplémentaires de la méthode par rapport à la publiées antérieurement17 est présenté ici. En outre, un ensemble de résultats typiques obtenus dans un certain nombre de différents types de cellules s’affiche, et important, plusieurs lignes de validations expérimentales de la méthode à l’aide de knockdown pharmacologique mais aussi génétique et approches knockout sont fournis. Pour un projet global de flux du protocole entier, voir la Figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
En résumé, le protocole décrit ici représente une méthode fiable et largement applicable pour surveiller l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères. Par rapport à la méthode originale12,16, nous avons supprimé un certain nombre d’étapes inutiles, simplifié plusieurs des étapes restantes et introduit une substantielle réduction d’échelle. Par conséquent, le protocole est grandement amélioré par rapport…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu financièrement par le Conseil norvégien de la recherche, l’Université d’Oslo, le Anders Jahre Foundation, la Fondation de Nansen et l’héritage dans la mémoire de Henrik Homan. Nous remercions m. Noboru Mizushima pour le ATG5 + / + MEFs et ATG5-/-MEFs, Dr Masaaki Komatsu pour le ATG7 + / + MEFs et ATG7-/-MEFs et Dr Shizuo Akira pour le ATG9A + / + MEFs et ATG9A-/-MEFs. Nous remercions Frank Sætre pour assistance technique et Dr par O. Seglen pour des débats constructifs méthodologiques.
Materials
| 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 211-2130 and 211-2120 | |
| 12-well plates | Falcon | 353043 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | A7089 | Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Dissolve in DMSO |
| BJ cells | ATCC | CRL-2522 | use at passage <30 |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 422361V | |
| Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Cover glass for the Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µl, 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Earle's balanced salt solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | conatains 0.1% glucose |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Electroporation cuvette (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Exponential decay wave electroporator | BTX Harvard Apparatus | EMC 630 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | 10% final concentration in RPMI 1640 medium |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months |
| Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher | 13778150 | |
| LNCaP cells | ATCC | CRL-1740 | use at passage <30 |
| 3-Methyl Adenine (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Heat stock to 65 °C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration |
| Refridgerated Microcentrifuge | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 hydrochloride (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO. |
| MaxMat Multianalyzer instrument | Erba Diagnostics | PL-II | |
| MCF7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher | 31985062 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Pipette tips 3 (0.5-20 µl) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (1-200 µl) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (100-1000µl) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipettes | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year. |
| Pyruvate | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| RPE-1 cells (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO. |
| Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Sucrose | VWR | 443816T | 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO. |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1% final |
| Trypan Blue stain 0.4% | Molecular Probes | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0.01% final |
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