Effektiv kontrol af myg bårne virus transmission, er kendskab til vektor potentiale af respektive myg af særlig interesse. Vi beskriver tvungen spytsekretion som en metode til at analysere vektor kompetence af Aedes albopictus og tre forskellige Culex taxa til transmission af Zika virus.
Vektor kompetence er defineret som en myg arter potentiale til at overføre en myg-bårne virus (mobovirus) til en hvirveldyr vært. Levedygtige viruspartikler er forsendt under en blodmel via spyt af en inficeret myg. Tvungen spytsekretion assays tillade bestemmelse af vektor potentiale på grundlag af enkelt myg, undgå brugen af dyreforsøg. Metoden er egnet til at analysere et stort antal af myg i et eksperiment inden for en kort periode. Tvungen spytsekretion assays blev anvendt til at analysere 856 enkelte myg fanget i Tyskland, herunder to forskellige Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium samt Aedes albopictus, der blev eksperimentelt inficeret med Zika virus (ZIKV) og rugede på 18 ° C eller 27 ° C i to og tre uger. Resultaterne angives manglen vektor kompetence i de forskellige Culex taxa til ZIKV. Derimod var Aedes albopictus modtagelige for ZIKV, men kun på 27 ° C, med overførselshastigheder svarende til en Aedes aegypti laboratorium koloni testet parallelt.
I 2015, Zika virus (ZIKV), en myg-bårne virus (mobovirus) tilhører familien Flaviviridae, opstået i Columbia og Brasilien og spredes hurtigt over hele Amerika og Caribien, forårsager en epidemi med bemærkelsesværdige numre af forbundet kliniske tilfælde af mikrocefali og Guillain-Barre syndrom1. Myg arter Aedes aegypti og Aedes albopictus betragtes som de primære og sekundære vektorer af ZIKV2, men andre arter af slægten Aedes har også vist sig for at have eksperimentel vektor kompetence3 . I modsætning til Aedes arter er de fleste af Culex arter testet indtil videre ikke købedygtig overføre virus4. Blot, givet data for Culex quinquefasciatus inkonklusive resultater3. I øjeblikket mangler oplysninger om myg vektor kompetence for ZIKV under moderate temperaturforhold (< 20 ° C). Disse oplysninger er imidlertid væsentlig for risikovurderinger af mulige breder sig til områder med tempereret klima såsom Centraleuropa.
Kompetente vektor for ZIKV er i stand til at erhverve, vedligeholde, forstærke og endelig overføre virus. Derfor er test myg organer eller dele af organer, herunder ben, midgut, hoved eller spytkirtler, for ZIKV ikke tilstrækkeligt at fastslå vektor kompetence. Det er obligatorisk at teste for smitsomme viruspartikler inden for frigivne spyt. For at vurdere vektor kompetence, skal både infektion sats (IR, antallet af ZIKV-positive myg organer pr. antal engorged myg) og transmission sats (TR, antallet af myg med ZIKV-positive spyt pr. antal ZIKV-positive myg organer), være bestemmes. IRs af myg kan analyseres nemt ved blot homogenisering myg efterfulgt af en reverse transkriptase real-time polymerase kæde reaktion (RT-qPCR) rettet mod ZIKV. Derudover kan infektionen karakteriseres yderligere ved at bestemme de virale kopi numre pr. myg. Derimod bygger analyse af overførselshastigheder på påvisning af levedygtige viruspartikler i spyt af enkelte myg. Dette kan opnås ved fodring med inficerede myg på modtagelige vært dyr, efterfulgt af en analyse af viræmi i vært5. Dog denne metode bygger på passende modelorganismer, og er dyrt og begrænset af dyrevelfærd forordninger. Undgå brugen af forsøgsdyr til at analysere overførselshastigheder og reducere omkostningerne, kunstige re fodring systemer ved hjælp af blod dråber har været beskrevet6. Test på individuelle skala kombineret med et stort antal individer er dog vanskeligt og tidskrævende. Den første beskrivelse af en spytsekretion assay på individuelle skala blev offentliggjort i 19667 og i løbet af de seneste år, blevet tvunget spytsekretion eksperimenter metode til at evaluere vektor kompetence myg3,8 .
Baseret på vores vektor kompetence undersøgelse af centraleuropæiske myg offentliggjort for nylig9, vi beskriver tvungen spytsekretion, som rapporteret af Anderson mfl. 8 med nogle ændringer. Denne metode giver høj overførselshastighed standardiseret eksperimenter under høj biosikkerhed ensartede betingelser (BSL-3) og omfatter identifikation af aktive virus af celle kultur baseret assays. Eksperimenter beskrevet her omfatter 856 myg. De var smittet med ZIKV af kunstige blodmel og efterfølgende analyseres for forekomst af smitsomme viruspartikler i spyt. Myg tilføres forsøg omfattede to veletablerede laboratorium populationer af Ae. aegypti og Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. p. molestus), samt felt fanget Culex pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) og to Ae. albopictus populationer. Med undtagelse af en af de to populationer, Ae. albopictus , som blev indsamlet i Italien, blev alle myg indsamlet i Tyskland.
Det er tidligere påvist, at resultater opnået med tvungen spytsekretion er i tråd med klassisk re fodring eksperimenter6. Men både i re fodring eksperimenter og i vores præsenteret metode til tvungen spytsekretion, det er umuligt at direkte bevis spytsekretion aktivitet eller overvåge udgivelsen af spyt. Prøver for at bevise spytsekretion aktivitet, kunne blive testet for andre komponenter til stede i spyt (fx., proteiner, kulhydrater, osv.). Desuden vil yderligere qPCRs tillade påvisning af viral RNA kopier. Dette kræver dog, opdeling af spytprøver til forskellige analyser, der kan begrænse følsomheden i celle kultur assay i meget lav partikel numre. Igen, kan dette føre til en undervurdering af de beslutsomme overførselshastigheder.
For reproducerbare resultater er det nødvendigt at sikre, at alle myg forbliver i live indtil slutningen af forsøget. Dette styres af visuelt overvågning krop bevægelse aktivitet af myg. Princippet om anvendelse af spytsekretion assay for en given myg arter har desuden skal testes ved at fodre kontrol virus, der er kendt til sendes med dette specifikke myg arter. Omvendt, har hver virus tilføres et eksperiment afprøves i en modtagelig myg.
Tvungen spytsekretion assays har mange fordele. Høje antal myg kan testes samtidigt på en enkelt model base under kontrollerede standardiserede betingelser uden konflikt med dyrevelfærd forordninger9.
Metoden bruges af flere laboratorier. Dog afvige nøjagtige opsætninger, som kan føre til forskelle i resultaterne mellem laboratorier. En kritisk komponent er kapillær at indsamle spyt, som kan være lavet af glas14 eller plast15. For at overholde de høje sikkerhedsbestemmelser for en biosikkerhed niveau 3 insectary, brugte vi plast filter tips i stedet for glas kapillærer, dermed reducere risikoen for skader. Filter tips har desuden den fordel, de indsamlede væske let overføres, ved hjælp af en pipette.
Opsætningen af den tvungne spytsekretion assay præsenteres her er baseret på to efterforskere arbejde sammen og dele opgaver. Tilbagetrækningen af myg er udført af én person, mens den anden samtidig forbereder tvungen spytsekretion setup. Dette væsentligt reducerer tid, håndtering og minimerer risikoen af prøven Skift som skiftende mellem demobilisering-arbejdspladsen og savlen-pladen er ikke nødvendigt. Desuden, det giver mulighed for markedsføring myg tvungen spytsekretion enhed umiddelbart efter hjemsendelsen. Denne temmelig korte myg Ekspeditionstiden er afgørende for vellykket tvungen savlen. Endelig kan myg overvåges direkte til motilitet gennem hele eksperimentet.
Savlen analysen præsenteres her bruges til at få indsigt i vektor potentiale af myg arter. Dog at besvare nogle andre specifikke spørgsmål (fx., antallet af myggestik, der er nødvendige for at smitte hvirveldyr), animalsk eksperimenter kan stadig være påkrævet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Ella Weinert, Michelle Helms og Marlis Badusche for fremragende teknisk bistand, Jessica Börstler analyser af Culex myg, Norbert Becker og Björn Pluskota for at give Aedes albopictus æg og Olli Vapalahti for leverer virus materiel. ML blev støttet af sammenslutningen Leibniz; give nummer SAW-2014-SGN-3.
Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
Vero cells | BNITM | ||
Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
hand motor mixer | carl roth | sold out | |
micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
DMEM | P0403550 | ||
L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
Fructose | carl roth | 4981.5 | |
Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
FBS | PAN | ||
Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
MEM NAA | PAN | P0832100 | |
Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
Light Cycler | Roche | 480 II | |
Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
Modeling clay | no specific provider | ||
King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |