Per un controllo efficace della zanzara a carico di trasmissione del virus, la conoscenza del potenziale vettoriale delle rispettive zanzare è di particolare interesse. Descriviamo la salivazione forzato come un metodo per analizzare la competenza vettoriale di Aedes albopictus e tre diversi Culex taxa per la trasmissione del virus di Zika.
Competenza vettoriale è definito come il potenziale di una specie di zanzara per trasmettere un virus zanzara (mobovirus) ad un ospite vertebrato. Particelle di virus vitale vengono trasmessi durante un pasto di sangue tramite la saliva di una zanzara infetta. Saggi di salivazione forzata consentono di stabilire il potenziale di vettore sulla base di singole zanzare, evitando l’uso di esperimenti sugli animali. Il metodo è adatto per analizzare un gran numero di zanzare in un esperimento entro un breve periodo di tempo. Analisi di salivazione forzata sono state usate per analizzare 856 individuali zanzare intrappolate in Germania, tra cui due diversi biotipi di Culex pipiens pipiens , Culex torrentium nonché Aedes albopictus, che sono stati infettati sperimentalmente con il virus di Zika (ZIKV) e incubate a 18 ° C o 27 ° C per due o tre settimane. I risultati hanno indicato la mancanza di competenza vettoriale dei taxa diversi Culex per ZIKV. Al contrario, Aedes albopictus era suscettibile di ZIKV, ma solo a 27 ° C, con velocità di trasmissione simile a una colonia di laboratorio di Aedes aegypti testata in parallelo.
Nel 2015, virus di Zika (ZIKV), un virus zanzara (mobovirus), appartenente alla famiglia dei Flaviviridae, emerse in Colombia e in Brasile e si diffuse rapidamente in tutta l’America e i Caraibi, causando un’epidemia con un notevole numero di associati casi clinici di microcefalia e sindrome di Guillain-Barré1. Le zanzare della specie Aedes aegypti e Aedes albopictus sono considerate i vettori primari e secondari di ZIKV2, ma altre specie del genere Aedes hanno anche dimostrato di avere competenza vettoriale sperimentale3 . A differenza delle specie Aedes , la maggior parte della specie Culex testato finora non sono in grado di trasmettere il virus4. Semplicemente, i dati per Culex quinquefasciatus fornito risultati inconcludenti3. Allo stato attuale, manca un’informazione su competenza vettoriale zanzara per ZIKV in condizioni di temperatura moderata (< 20 ° C). Tuttavia, queste informazioni sono notevole per le valutazioni del rischio di spread possibili alle regioni con clima temperato come l'Europa centrale.
Un vettore competente per ZIKV è in grado di acquisire, mantenere, amplificare e infine trasmettere il virus. Di conseguenza, test zanzara corpi o parti di corpi, tra le gambe, del midgut, testa o ghiandole salivari, per ZIKV non è sufficiente per determinare la competenza vettoriale. È obbligatorio per verificare per particelle virali infettive all’interno della saliva rilasciata. Per valutare la competenza vettoriale, sia il tasso di infezione (IR, numero di corpi di zanzara ZIKV-positivo per il numero di zanzare gonfio) e velocità di trasmissione (TR, numero di zanzare con la saliva ZIKV-positivo per il numero di corpi di zanzara ZIKV-positivi), devono essere determinato. IRs di zanzare possono essere facilmente analizzati dalle zanzare semplicemente omogeneizzazione, seguite da una reazione a catena d’inversione-transcriptase della polimerasi in tempo reale (RT-qPCR) ZIKV di targeting. Inoltre, l’infezione può essere ulteriormente caratterizzato determinando i numeri di copia virale per zanzare. Al contrario, l’analisi dei tassi di trasmissione si basa sulla rilevazione delle particelle di virus vitale nella saliva delle zanzare individuali. Ciò può essere ottenuto alimentandosi di zanzare infette su animali ospite suscettibile, seguiti dall’analisi della viremia in host5. Tuttavia, questo metodo si basa sugli organismi di modello adatto ed è costoso e limitato dalle norme di benessere degli animali. Per evitare l’uso degli animali da laboratorio per l’analisi dei tassi di trasmissione e di ridurre i costi, ri-sistemi di alimentazione artificiale usando il sangue le goccioline sono stati descritti6. Tuttavia, test su scala individuale combinato con un elevato numero di individui è difficile e richiede tempo. La prima descrizione di un dosaggio di salivazione su scala individuale è stata pubblicata nel 19667 e durante gli anni recenti, salivazione forzata esperimenti sono diventati il metodo di scelta per valutare la competenza di vettore di zanzare3,8 .
Basato sul nostro studio di competenza vettoriale di Europa centrale le zanzare recentemente pubblicato9, descriviamo forzata salivazione, come riportato da Anderson et al. 8 con alcune modifiche. Questo metodo consente a resa elevata standardizzata esperimenti in condizioni di biosicurezza alto livello (BSL-3) e include l’identificazione del virus attivo di cultura basata su cellule saggi. Gli esperimenti descritti qui includono 856 zanzare. Sono stati infettati con ZIKV da farine di sangue artificiale e successivamente analizzati per la presenza di particelle virali infettive nella saliva. Le zanzare introdotte in esperimenti comprendeva due laboratorio consolidata popolazioni di biotipo Ae. aegypti e Culex pipiens pipiens molestus (Cx. p. molestus), come pure il campo catturato Culex pipiens pipiens biotipo pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) e due popolazioni di Ae. albopictus . Con l’eccezione di una delle due popolazioni Ae. albopictus , che è stato raccolto in Italia, tutte le zanzare sono stati raccolte in Germania.
Precedentemente è stato indicato che i risultati ottenuti con salivazione forzata sono in linea con la classica rialimentazione esperimenti6. Tuttavia, ri-alimentazione esperimenti sia in nostro metodo presentato della salivazione forzata, è Impossibile direttamente prova attività salivazione o monitorare il rilascio di saliva. Per dimostrare l’attività di salivazione, campioni potrebbero essere testati per altri componenti presentano nella saliva (ad es., proteine, carboidrati, ecc.). Inoltre, ulteriori qPCRs dovrebbe consentire il rilevamento di copie di RNA virale. Questo, tuttavia, richiede frazionamento dei campioni di saliva per varie analisi, che possono limitare la sensibilità nell’analisi della cultura delle cellule in caso di numeri di particelle molto basso. A sua volta, questo potrebbe portare ad una sottovalutazione dei tassi di trasmissione determinato.
Per ottenere risultati riproducibili, è necessario garantire che tutte le zanzare rimanere in vita fino alla fine dell’esperimento. Questo è controllato controllando visivamente l’attività di movimento del corpo delle zanzare. Inoltre, l’uso del principio del dosaggio salivazione per una specie di zanzara dato deve essere testato alimentando virus di controllo, che sono conosciuti per essere trasmesso da questa specie di zanzara specifici. Viceversa, ogni virus introdotti in un esperimento deve essere testato in una zanzara suscettibile.
Saggi di salivazione forzata hanno molti vantaggi. Un numero elevato di zanzare possa essere testato contemporaneamente su un singolo esemplare base in condizioni standardizzate controllate senza entrare in conflitto con norme di benessere degli animali9.
Il metodo è utilizzato da diversi laboratori. Tuttavia, messe a punto esatti può variare, che può portare a differenze nei risultati tra i laboratori. Un componente critico è il capillare per raccogliere la saliva, che può essere fatto di vetro14 o plastica15. Per rispettare le norme di sicurezza ad alta di un insectary di livello 3 di biosicurezza, abbiamo usato plastica puntali con filtro invece di tubi capillari in vetro, riducendo così il rischio di lesioni. Inoltre, puntali con filtro hanno il vantaggio che il liquido raccolto possa essere trasferito facilmente utilizzando una pipetta.
L’installazione del dosaggio salivazione forzata qui presentato è basato su due ricercatori lavorano insieme e la condivisione di compiti. Smobilitazione della zanzara viene eseguita da una sola persona, mentre l’altro prepara simultaneamente l’installazione forzata salivazione. Ciò notevolmente riduce i tempi di movimentazione e minimizza il rischio di campione di commutazione come cambiare tra la smobilitazione-luogo di lavoro e la salivazione-piastra non è necessario. Inoltre, esso consente di posizionare le zanzare sul dispositivo salivazione forzato immediatamente dopo la smobilitazione. Questa zanzara piuttosto breve tempo di trattamento è essenziale per il successo salivazione forzata. Infine, le zanzare possono essere controllate direttamente per motilità in tutta l’intero esperimento.
Il dosaggio di salivazione presentato qui è usato per avere una chiara comprensione del potenziale vettoriale di specie di zanzare. Tuttavia, per rispondere a domande specifiche (ad es., i numeri di punture di zanzare che sono necessari per infettano i vertebrati), animale esperimenti potrebbero essere ancora necessari.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Ella Weinert, Michelle Helms e Marlis Badusche per l’eccellente assistenza tecnica, Jessica Börstler per analisi di zanzare Culex , Norbert Becker e Björn Pluskota per la fornitura di Aedes albopictus uova e Olli Vapalahti per fornendo lo stock di virus. ML è stato sostenuto dall’associazione Leibniz; concessione numero SAW-2014-SGN-3.
Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
Vero cells | BNITM | ||
Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
hand motor mixer | carl roth | sold out | |
micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
DMEM | P0403550 | ||
L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
Fructose | carl roth | 4981.5 | |
Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
FBS | PAN | ||
Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
MEM NAA | PAN | P0832100 | |
Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
Light Cycler | Roche | 480 II | |
Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
Modeling clay | no specific provider | ||
King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |