För effektiv kontroll av mygga borne virus överföring, är kunskapen av vektor potential respektive myggor av särskilt intresse. Vi beskriver Tvingad salivering som en metod att analysera vektor behörighetsområde Aedes albopictus och tre olika Culex taxa för överföring av zikavirus.
Vector kompetens definieras som en mygga arter potential att överföra en moskitburen virus (mobovirus) till en vertebrate värd. Livskraftig viruspartiklarna överförs under en blodmjöl via saliv från en infekterad mygga. Tvingad salivering analyser tillåter att fastställa vektor potential utifrån enstaka myggor, undvika användning av djurförsök. Metoden är lämplig att analysera ett stort antal myggor i ett experiment inom en kort tidsperiod. Tvingad salivering analyser användes för att analysera 856 enskilda myggor fångade i Tyskland, inklusive två olika Culex pipiens pipiens biotyper, Culex torrentium samt Aedes albopictus, som var experimentellt infekterade med zikaviruset (ZIKV) och inkuberas vid 18 ° C eller 27 ° C i två och tre veckor. Resultaten indikerade avsaknaden av vektor kompetens av de olika Culex taxa för ZIKV. Däremot var Aedes albopictus mottagliga för ZIKV, men endast vid 27 ° C, med dataöverföringen klassar liknar en Aedes aegypti laboratorium koloni testas parallellt.
I 2015, zikavirus (ZIKV), en moskitburen virus (mobovirus) tillhör familjen flavivirus, uppstod i Columbia och Brasilien och spred sig snabbt över Amerika och Karibien, orsaka en epidemi med anmärkningsvärda antalet associerade kliniska fall av mikrocefali och Guillain – Barrés syndrom1. Myggor av arten Aedes aegypti och Aedes albopictus anses de primära och sekundära vektorerna ZIKV2, men andra arter av släktet Aedes har också visat sig ha experimentella vektor kompetens3 . I motsats till Aedes arter är de flesta av de Culex arter testat hittills inte kan överföra virus4. Data för Culex quinquefasciatus tillhandahålls endast, ofullständiga resultat3. För närvarande saknas information om mygga vektor behörighet för ZIKV vid måttlig temperatur (< 20 ° C). Denna information är dock betydande för riskbedömningarna för möjliga uppslag till områden med tempererat klimat såsom Centraleuropa.
En behörig vektor för ZIKV är att förvärva, bevara, förstärka och slutligen överför viruset. Därför är testning mygga kroppar eller delar av organ, inklusive ben, midgut, huvud eller spottkörtlar, för ZIKV inte tillräckligt att fastställa vektor kompetens. Det är obligatoriskt att testa för infektiösa viruspartiklar inom släppt saliv. För att bedöma vektor kompetens, måste både infektionsfrekvensen (IR, antal ZIKV-positiv mygga organ per antal svullna myggor) och överföringshastighet (TR, antal myggor med ZIKV-positiv saliv per antal ZIKV-positiv mygga organ), vara bestäms. IRs av myggor kan enkelt analyseras av enkelt homogeniserande myggor följt av en transkriptas realtid polymeras-kedjereaktion (RT-qPCR) inriktning ZIKV. Dessutom kan infektionen karakteriseras ytterligare genom att bestämma den virala kopia nummer per mygga. Däremot bygger analysen av överföringshastigheter på detektion av livskraftiga viruspartiklar i saliv från enskilda myggor. Detta kan uppnås genom utfodring av infekterade myggor på mottagliga värddjur, följt av analysen av viremi i värd5. Men denna metod förlitar sig på lämplig modellorganismer och är kostsamma och begränsad av djurskydd förordningar. Undvika användning av försöksdjur för att analysera överföringshastigheter och minska kostnaderna, med blod droppar har varit konstgjorda åter matningssystem beskrivs6. Tester på enskilda skala kombinerat med ett stort antal individer är dock svårt och tidskrävande. Den första beskrivningen av en salivering-analysen i enskilda skala publicerades 19667 och under de senaste åren blivit Tvingad salivering experiment metoden för val att utvärdera vektor behörighetsområde myggor3,8 .
Baserat på vår vektor kompetens studie av centraleuropeiska myggor nyligen publicerade9, beskriver vi Tvingad salivering som rapporterats av Anderson et al. 8 med vissa ändringar. Denna metod tillåter hög genomströmning standardiserade experiment hög biosäkerhet nivå villkor (BSL-3) och omfattar identifiering av aktiv virus av cell kultur baserat analyser. De experiment som beskrivs här inkluderar 856 myggor. De var smittade med ZIKV av konstgjorda blodmjöl och därefter analyseras för förekomst av infektiösa viruspartiklar i saliven. Myggen införs i experiment som består två väletablerade laboratorium populationerna av Ae. aegypti och Culex pipiens pipiens biotyper molestus (Cx. s. molestus), samt fältet Fångad Culex pipiens pipiens biotyp pipiens (Cx. s. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) och två Ae. albopictus populationer. Med undantag för en av de två Ae. albopictus befolkningarna, som samlades in i Italien, samlades alla myggor i Tyskland.
Det har tidigare visat att resultat som erhålls med Tvingad salivering är förenliga med klassiskt åter utfodring experiment6. Dock är åter utfodring experiment såväl i våra presenterade metoden av påtvingad salivering, det omöjligt att direkt bevis salivering aktivitet eller övervaka utgivningen av saliv. För att bevisa salivering aktivitet, prover kunde testas för andra komponenter som finns i saliven (t.ex., proteiner, kolhydrater, etc.). Dessutom skulle ytterligare qPCRs möjliggöra upptäckt av viral RNA kopior. Detta kräver dock dela av saliv prover för olika analyser, vilket kan begränsa känslighet i cell-kultur analysen vid mycket låga partikel nummer. Detta kan i sin tur leda till en underskattning av de beslutsamma överföringshastigheter.
För reproducerbara resultat är det nödvändigt att säkerställa att alla myggor överleva fram till slutet av experimentet. Detta styrs genom att visuellt övervaka aktiviteten kroppen rörelse av myggor. Att principen salivering analysen för en given mygga arter har dessutom testas genom utfodring kontroll virus som är kända för att överföras av denna specifika mygga art. Vice versa, har varje virus som införs i ett experiment som ska testas i en mottagliga mygga.
Tvingad salivering analyser har många fördelar. Kicken numrerar av myggor kan provas samtidigt på en enstaka exemplar som bas under kontrollerade standardiserade förhållanden utan konflikt med djurskydd förordningar9.
Metoden används av flera laboratorier. Exakta uppställningar kan dock variera, vilket kan leda till skillnader i resultaten mellan laboratorier. En kritisk komponent är kapillären att samla saliv, som kan vara gjorda av glas14 eller plast15. För att uppfylla de höga säkerhetsföreskrifterna av en biosäkerhet nivå 3 insectary, använde vi plast filter tips istället för glas kapillärer, vilket minskar risken för skador. Filter tips har dessutom den fördelen att den insamlade vätskan enkelt kan överföras med hjälp av en pipett.
Inställningen av påtvingad salivering analysen presenteras här baseras på två utredare arbetar tillsammans och dela arbetsuppgifter. Demobilisera av mygga utförs av en person, medan den andra förbereder samtidigt påtvingad salivering setup. Det avsevärt minskar hanteringstiden och minimerar risken av provet växling som att byta mellan demobilisering-arbetsplatsen och salivering-plattan är inte nödvändigt. Dessutom tillåter det att placera myggor på Tvingad salivering enheten omedelbart efter demobilisering. Denna ganska korta mygga Hanteringstid är avgörande för framgångsrik Tvingad salivering. Slutligen, myggor kan övervakas direkt för motilitet i hela hela experimentet.
Salivering analysen presenteras här används för att få insikter i vektor potential av mygga arter. Dock att besvara vissa andra särskilda frågor (t.ex., numrerar av myggbett som behövs för att infektera ryggradsdjur), djur experiment kan fortfarande krävas.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Ella Weinert, Michelle Helms och Marlis Badusche för utmärkt teknisk assistans, Jessica Börstler för analyser av Culex myggor, Norbert Becker och Björn Pluskota för att tillhandahålla Aedes albopictus ägg och Olli Vapalahti för ger virus beståndet. ML stöddes av Leibniz samfundet; bevilja nummer SAW-2014-SGN-3.
Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
Vero cells | BNITM | ||
Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
hand motor mixer | carl roth | sold out | |
micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
DMEM | P0403550 | ||
L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
Fructose | carl roth | 4981.5 | |
Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
FBS | PAN | ||
Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
MEM NAA | PAN | P0832100 | |
Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
Light Cycler | Roche | 480 II | |
Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
Modeling clay | no specific provider | ||
King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |