Modellering Charcot-Marie-Tooth sjukdom In Vitro av Transfecting mus primära Motoneurons
Summary
Målet med denna teknik är att förbereda en höganrikat kultur av primära motoneurons (MNs) från murina ryggmärgen. För att utvärdera konsekvenserna av mutationer som orsakar MN sjukdomar, vi beskriver här isoleringen av dessa isolerade MNs och deras transfection av magnetofection.
Abstract
Neurodegeneration av spinal motoneurons (MNs) är inblandad i ett stort spektrum av neurologiska sjukdomar inklusive ALS, Charcot-Marie-Tooth sjukdom och spinal muskelatrofi, som är alla associerade med muskelatrofi. Primära kulturer av spinal MNs har använts allmänt att demonstrera medverkan av specifika gener i sådana sjukdomar och karakterisera cellulära konsekvenserna av deras mutationer. Detta protokoll modeller en primär MN kultur härstammar från Henderson och kollegor nyskapande arbete mer än tjugo år sedan. Det första detalj vi en metod att dissekera de främre hornsna av ryggmärgen från en mus embryo och isolera MNs från angränsande celler med hjälp av en täthetlutning. Sedan, vi presenterar ett nytt sätt att effektivt transfecting MNs med uttrycket plasmider använder magnetofection. Slutligen, vi illustrera hur fixar och immunostain primära MNs. använda neurofilament mutationer som orsakar Charcot-Marie-Tooth sjukdom typ 2, detta protokoll visar en kvalitativ metod att uttrycka proteiner av intresse och studera deras deltagande i MN tillväxt, underhåll och överlevnad.
Introduction
Neuromuskulära sjukdomar omfattar en mängd kliniskt och genetiskt distinkta patologier som kännetecknas av förändringen av muskler och/eller nervsystemet. På grund av framsteg inom sekvensering teknik, hundratals gener ansvariga för dessa sällsynta sjukdomar har identifierats under det senaste decenniet (lista finns på det Neuromuscular Disease Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Olika identifierade mutationer indikerar att olika mutationer i en gen kan orsaka olika fenotyper och sjukdomar1,2,3 och att mutationer i olika gener kan producera liknande fenotyper 4 , 5. i detta sammanhang finns det insatser för att utveckla cellular-modeller som kan bli kraftfulla verktyg för att analysera mutation konsekvenser och patologiska mekanismer.
Spinal MNs har stora somas ligger i ventrala hornsna av ryggmärgen, bildar långa axoner inrikta skeletala muskelfibrer och möjliggöra frivilliga rörelser genom frisättning av acetylkolin i neuromuskulära korsningar. Eftersom MNs påverkas av neuromuskulära sjukdomar såsom amyotrofisk lateral skleros, utvecklat Charcot-Marie-Tooth sjukdom (CMT), och spinal muskelatrofi, Dr Henderson och kollegor det första protokoll6 som tillåtna för odling av in vitro- spinal MNs och upptäckten av neurotrofa faktor GDNF7 (glial cell härledd neurotrofisk faktor). Tekniska förbättringar sedan dess har tillåtit för exaktare rening av spinal MNs och deras undertyper som använder FACS8, men anrikning av täthetlutningen förblir kraftfulla och används i laboratorier som arbetar med primära spinal MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. därefter är det också möjligt att erhålla betyget högre MN rening genom immunopanning genom att utnyttja ytan markör p75(NTR)15,16,17.
Ryggmärgen innehåller olika subtyper av cervix, bröstkorg och ryggradens MNs, liksom median och laterala motor kolumner som skiljer sig åt mellan deras läge i främre horn på en dorso-ventrala axel och bland målen innerverar de8, 18. primära MN kulturer kan återställa alla dessa MN undertyper i fysiologiska proportioner. Den största begränsningen av denna teknik är det låga antalet MNs erhålls vid slutet av förfarandet. i själva verket kan det förväntas få cirka 105 MNs från sex embryon, som passar för mikroskopi men begränsande för biokemi experiment. Att utföra experiment med mer standardiserade subtyper och riklig MNs (> 106 celler), embryonala stamceller-derived MNs övervägas18.
Transfection wild-type/mutant transgener eller knockdown endogena gener till primära MNs är ett snabbt och användbart verktyg för att dechiffrera physiopathological vägar, särskilt när musmodeller är inte tillgängliga. Magnetofection är en teknik för transfecting primära nervceller, liknar lipofection utan den relaterade neurotoxicitet. Transfection kan dessutom utföras på mogna nervceller efter flera dagar i vitro, till skillnad från tekniker som bygger på elektroporation9. En nackdel med denna teknik är dock att pärlorna binder nukleinsyror i kultur, orsakar buller i DAPI märkning. Virusinfektioner är sannolikt den mest effektiva tekniken för transfecting MNs; magnetofection kräver dock inte vissa säkerhetsrutiner som krävs för viral produktion och cellulära infektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
En av de kritiska punkterna i detta protokoll är att musembryon är dissekeras på en exakt tidsfönster under utveckling (E12.5) för att optimera mängden MNs erhålls vid slutet. Dessutom för optimal avkastning, bör dissektion utföras på morgonen eller tidigt på eftermiddagen. Innan E12.5 (t.ex. på E11.5) är dissektion svårt, särskilt när det gäller eliminering av hjärnhinnorna. Efter E12.5 sjunker antalet erhållna MNs. För att styra det embryo utvecklingsstadiet, är vuxna honor och hanar för…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka de ”Association pour le développement de la neurogénétique” för Dr. Jacquier’s fellowship och AFM-Telethon för dess stöd genom MyoNeurAlp strategisk plan. Vi vill också tacka Dr Chris Henderson, Dr William Camu, Dr Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul och Dr Georg Haase, som deltog i utveckla och förbättra tekniken och sprida sin kunskap.
Materials
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
