एक उपंयास सर्जिकल में Vivo आंशिक जिगर इंजीनियरिंग के लिए एक नींव के रूप में शल्य चिकित्सा तकनीक
Summary
हम भविष्य में vivo आंशिक जिगर इंजीनियरिंग में आगे की पढ़ाई के लिए एक शर्त के रूप में vivo में एक जिगर पालि छिड़काव मॉडल में एक के लिए एक उपंयास सर्जिकल तकनीक की स्थापना ।
Abstract
अंग इंजीनियरिंग संभवतः प्रत्यारोपण में इस्तेमाल किया जा सकता है कि जिगर अंग विकल्प उत्पन्न करने के लिए एक उपंयास रणनीति है । हाल ही में, vivo में शामिल है जिगर इंजीनियरिंग, vivo अंग decellularization में जनसंख्या के बाद सहित, पूर्व vivo जिगर इंजीनियरिंग पर एक होनहार दृष्टिकोण के रूप में उभरा है । हालांकि, पश्चात अस्तित्व प्राप्त नहीं किया गया । इस अध्ययन का उद्देश्य vivo में चुनिंदा जिगर पालि छिड़काव में vivo जिगर इंजीनियरिंग के लिए एक शर्त के रूप में चूहों में के एक उपंयास शल्य चिकित्सा तकनीक विकसित करना है । हम केवल बाएँ पार्श्व पालि के माध्यम से एक सर्किट बाईपास उत्पन्न करते हैं । फिर, वाम पार्श्व पालि heparinized खारा के साथ perfused है । प्रयोग 4 समूहों के साथ किया जाता है (n = प्रति समूह 3 चूहों) 20 मिनट, 2 एच, 3 एच, और 4 एच के विभिंन छिड़काव बार के आधार पर अस्तित्व, साथ ही रंग की macroscopically दिखाई परिवर्तन और histologically में रक्त कोशिकाओं के अभाव निर्धारित पोर्टल त्रय और sinusoids, एक सफल मॉडल स्थापना के लिए एक संकेतक के रूप में लिया जाता है । वाम पार्श्व पालि के चयनात्मक छिड़काव के बाद, हम मानते है कि वाम पार्श्व पालि, वास्तव में, लाल से पीला बेहोश हो गया । एक ऊतकवैज्ञानिक आकलन में, कोई रक्त कोशिकाओं पोर्टल नस की शाखा में दिखाई देते हैं, केंद्रीय नस, और sinusoids । वाम पार्श्व पालि अवरुद्ध जहाजों को फिर से खोलने के बाद लाल हो जाता है । 12/12 चूहों से अधिक एक सप्ताह के लिए प्रक्रिया बच । हम vivo एकल जिगर पालि छिड़काव में एक सप्ताह से अधिक की एक लंबी उत्तरजीविता अवधि के साथ के लिए एक शल्य मॉडल की रिपोर्ट करने के लिए पहली बार कर रहे हैं । पहले प्रकाशित रिपोर्ट के विपरीत, इस तकनीक का सबसे महत्वपूर्ण लाभ यहां प्रस्तुत किया है कि जिगर की ७०% की छिड़काव पूरी प्रक्रिया में बनाए रखा है । इस तकनीक की स्थापना में vivo आंशिक जिगर इंजीनियरिंग में decellularization और recellularization सहित चूहों, के लिए एक नींव प्रदान करता है ।
Introduction
अंग प्रत्यारोपण के लिए संकेत लगातार विस्तार कर रहे हैं । इसके विपरीत, अंग दान दरों और अंगों की समग्र गुणवत्ता में गिरावट आ रही है, भ्रष्टाचार के लिए एक बढ़ती मांग के लिए अग्रणी । जिगर प्रत्यारोपण प्रतीक्षा सूची में शामिल उंमीदवारों की संख्या में वृद्धि जारी (जैसे, संयुक्त राज्य अमेरिका में, ११,३४० रोगियों २०१६ में जोड़ा गया, २०१५ में १०,६३६ के साथ तुलना में)1। पर्याप्त प्रयासों के बावजूद उपलब्ध अंगों की संख्या नैदानिक जरूरतों को पूरा नहीं करती. जिगर की बीमारी की वृद्धि की घटनाओं के कारण, अंत चरण जिगर रोगों के साथ कई रोगियों प्रत्यारोपण प्रतीक्षा सूची पर मरने से पहले एक दाता अंग उपलब्ध हो जाता है । दाता जिगर भ्रष्टाचार के लिए भारी मांग को पूरा करने के लिए, वैकल्पिक जिगर ऊतक इंजीनियरिंग सिद्धांतों का उपयोग कर दृष्टिकोण सक्रिय रूप से2का पीछा किया जा रहा है । आजकल, जिगर इंजीनियरिंग के एक नए विकसित जैविक तकनीक संभवतः इस कमी को दूर कर सकता है ।
जिगर इंजीनियरिंग दो कदम होते हैं: एक acellular पाड़ की पीढ़ी, पाड़ के एक जनसंख्या के बाद । एक जैविक acellular जिगर पाड़ प्राप्त करने के लिए, explanted जिगर ईओण या ईओण डिटर्जेंट, जो जिगर से सेलुलर सामग्री को दूर कर सकते है के साथ संवहनी प्रणाली के माध्यम से perfused है । सबसे पिछले अध्ययनों में, एक जैविक acellular जिगर पाड़ सोडियम dodecyl सल्फेट और TritonX100 के संयोजन के साथ जिगर की छिड़काव द्वारा हासिल किया गया था । नतीजतन, सभी कोशिकाओं को हटा दिया गया है, जबकि extracellular मैट्रिक्स की संरचना बनाए रखा गया था । अंग पाड़ों परिपक्व कोशिकाओं, hepatocellular, साथ ही साथ endothelial सेल लाइनों, और प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के साथ या बिना endothelial कोशिकाओं या mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) के एक साथ आवेदन के साथ फिर से बीज थे । सबसे शोधकर्ताओं ने पूर्व vivo जिगर इंजीनियरिंग पर ध्यान केंद्रित3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. हालांकि, सबसे पिछले अध्ययन में, repopulateded पाड़ cubes के केवल छोटे टुकड़े अलग heterotopic आरोपण साइटों में प्रत्यारोपित किया गया । कुछ अध्ययनों में आंशिक आबाद पाड़ों एक सहायक भ्रष्टाचार के रूप में प्रत्यारोपण किया गया । हालांकि, अधिकतम रिपोर्ट जीवित रहने का समय केवल ७२ ज8,14था । जहां तक हम जानते हैं, एक repopulateded पूर्ण जिगर भ्रष्टाचार के orthotopic ट्रांसप्लांटेशन अभी तक प्रदर्शन या के बारे में प्रकाशित नहीं किया गया है । लंबी अवधि के समारोह और इंजीनियर अंगों के प्रत्यारोपण उनके शैशव में अब भी कर रहे हैं । इसलिए, पूर्व vivo जिगर इंजीनियरिंग के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण की जरूरत है ।
vivo जिगर इंजीनियरिंग में शारीरिक स्थितियों के तहत यकृत पुनर्जनसंख्या का अध्ययन करने के लिए एक विकल्प का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । vivo लीवर इंजीनियरिंग की तुलना में विवो लिवर इंजीनियरिंग के फायदों को कई गुना कर रहे हैं । में vivo repopulateded आंशिक जिगर पाड़ उचित तापमान के साथ शारीरिक रक्त छिड़काव के अधीन है, पर्याप्त ऑक्सीजन, पोषक तत्वों, और कृत्रिम संस्कृति माध्यम के साथ पूर्व vivo छिड़काव के विपरीत वृद्धि कारकों. इसके अलावा, शेष आंशिक सामांय जिगर यकृत समारोह का कहना है, मुख्य रूप से दीर्घकालिक अस्तित्व की अनुमति । के बाद से एक प्रत्यारोपित पूर्व vivo इंजीनियर जिगर भ्रष्टाचार अभी भी अपने जिगर8समारोह द्वारा प्रयोगात्मक पशुओं के दीर्घकालिक अस्तित्व को बनाए रखने में असमर्थ है, हम कल्पना है कि vivo आंशिक जिगर engineeringwould में अंततः एक हो मॉडल का वादा आगे पूर्व vivoसे अब अस्तित्व टिप्पणियों के साथ इंजीनियर जिगर के विकास का अध्ययन करने के लिए ।
हाल ही में, एक अनुसंधान समूह (पैन और सहयोगियों) प्रस्तुत किया, पहली बार के लिए, vivo जिगर इंजीनियरिंग15 में की एक तकनीक । उन्होंने शारीरिक और तकनीकी चुनौतियों के बावजूद चूहों के रहने में सम्यक अवर यकृत पालि के पृथक छिड़काव को हासिल किया. वे vivo पुनर्जनसंख्या में एक चूहे प्राथमिक hepatocyte सेल लाइन का उपयोग कर के पहले intraoperative परिणामों की सूचना दी । हालांकि, इसमें वीवो सर्जिकल छिड़काव मॉडल ऑफ पैन एट अल. नुकसान है । वे पूरी तरह से पोर्टल नस और अवर वेना कावा अवरुद्ध की कीमत पर चूहों में एकल जिगर पालि छिड़काव हासिल की है, जो पशु को गंभीर नुकसान का कारण हो सकता है । प्रायोगिक चूहों intraoperative प्रेक्षण समय के केवल 6 घंटे के बाद बलि दी गई । इसलिए, में vivo जिगर पालि छिड़काव तकनीक पश्चात अस्तित्व प्राप्त करने के लिए और अधिक सुधार की जरूरत है ।
हम vivo जिगर पालि छिड़काव में के लिए एक उपंयास अस्तित्व मॉडल विकसित,16चूहे की यकृत एनाटॉमी के पिछले अध्ययनों के आधार पर, चूहों17में hemodynamic निगरानी के लिए पोर्टल नस cannulation तकनीक, और जिगर की इंजीनियरिंग 18 , 19. प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण कदम चित्र 1a – 1Eमें सचित्र हैं ।
यह तकनीक उन लोगों के लिए उपयुक्त है जो दवाओं के साथ अर्क द्वारा आंशिक अंग उपचार पर बुनियादी शोध के लिए वीवो छिड़काव मॉडल में , vivo decellularization में अंग रोगों के लिए एक रासायनिक लकीर के रूप में उपयोग करना चाहते हैं (उदा. , लीवर कैंसर), vivo सेल संस्कृति में एक सेल् फी मैट्रिक्स की तुलना में पूर्व vivo दो आयामी और तीन आयामी सेल कल्चर सिस्टम20,21,22,23 , 24 , 25 , 26, और decellularization और पुनर्जनसंख्या द्वारा vivo लीवर इंजीनियरिंग में ।
Protocol
Representative Results
Discussion
अवरुद्ध और cannulating एक द्रव प्रवेश के रूप में एक कैथेटर के साथ छोड़ दिया पोर्टल नस और एक तरल पदार्थ आउटलेट के रूप में एक और कैथेटर के साथ छोड़ दिया पार्श्व यकृत नस, हम सफलतापूर्वक वाम पार्श्व पालि के भीतर vivo द?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक को एनाटॉमी मैं, जेना विश्वविद्यालय अस्पताल के संस्थान से जेएनएन Geiling शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, चूहे जिगर शरीर रचना के योजनाबद्ध चित्र के उत्पादन के लिए ।
Materials
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon | ||
References
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
