Encellede Transcriptomic analyser av musen bukspyttkjertelen endokrine celler
Summary
Vi beskriver en metode for isolering av endokrine celler fra embryonale, neonatal og postnatal pancreases etterfulgt av encellede RNA sekvensering. Denne metoden kan analyser av bukspyttkjertelen endokrine avstamning utvikling, celle heterogenitet og transcriptomic dynamics.
Abstract
Bukspyttkjertelen endokrine celler som er gruppert i holmer, regulerer blod glukose stabilitet og energi metabolisme. De ulike celletyper i øyer, inkludert insulin sekresjon β celler, er differensiert fra vanlige endokrine progenitors under embryonale scenen. Umodne endokrine celler utvide via celle spredning og modne under en lang utviklingsmessige barseltiden. Imidlertid er mekanismene bak disse prosessene ikke klart definert. Encellede RNA-sekvensering er en lovende metode for karakterisering av ulike celle populasjoner og sporing celle avstamning differensiering trasé. Her beskriver vi en metode for den encellede RNA-sekvensering av isolerte bukspyttkjertelen β celler fra embryonale, neonatal og postnatal pancreases.
Introduction
Bukspyttkjertelen er et viktig metabolsk organ i pattedyr. Bukspyttkjertelen består av endokrine og exocrine avdelinger. Bukspyttkjertelen endokrine cellene, inkludert insulin-produserende β celler og produserer glukagon α celler, klynge sammen i holmer Langerhans og regulere coordinately systemisk glukose homeostase. Dysfunksjon endokrine cellene fører til diabetes mellitus, som har blitt et stort folkehelseproblem over hele verden.
Bukspyttkjertelen endokrine celler er avledet fra Ngn3+ progenitors under embryogenesis1. Senere, i perinatalperioden sprer endokrine cellene til skjemaet umodne holmer. Disse umodne celler fortsette å utvikle og gradvis bli moden holmer, som blir rikt Stangeriaceae for å regulere blod glukose homeostase i voksne2.
Selv om en gruppe transcriptional faktorer er identifisert som regulerer β celledifferensiering, er presis modning veien β celler fortsatt uklart. Videre omfatter β celle modning prosessen også regulering av celle nummer ekspansjon3,4 og generering av mobilnettet heterogenitet5,6. Imidlertid har regulatoriske mekanismer av disse prosessene ikke vært godt undersøkt.
Encellede RNA-sekvensering er en kraftig tilnærming kan profil celle subpopulasjoner og spore celle avstamning utviklingsmessige trasé7. Utnytter denne teknologien, nøkkelen hendelser som oppstår under bukspyttkjertelen Holme utvikling kan tyde på encellede nivå8. Blant encellede RNA-sekvensering protokollene tillater Smart-seq2 generering av full lengde cDNA med økt følsomhet og nøyaktighet, og bruk av standard reagenser lavere kostnader9. Smart-seq2 tar ca to dager å konstruere et cDNA bibliotek for sekvensering10.
Her foreslår vi en metode for isolering av fluorescens-merket β celler fra pancreases av fetal voksen Ins1-RFP transgene mus11, bruke fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS), og ytelsen til transcriptomic analyserer på den encellede nivå, ved hjelp av Smart-seq2 teknologi (figur 1). Denne protokollen kan utvides for å analysere transcriptomes alle bukspyttkjertelen endokrine celletyper i normal, patologiske og aldring stater.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen viste vi en effektiv og lett-å-bruke metode for å studere encellede uttrykket profiler av bukspyttkjertelen β celler. Denne metoden kan brukes til å isolere endokrine celler fra embryonale, neonatal og postnatal pancreases og utføre encellede transcriptomic analyser.
Det viktigste trinnet er isolering av enkelt β celler i god stand. Fullt parfyme pancreases svare bedre senere fordøyelsen. Utilstrekkelig perfusjon, som vanligvis oppstår i dorsal bukspyttkjertelen, vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker National Center for Protein Sciences, Beijing (Peking University) og Peking-Tsinghua Center for Life Science Computing plattform. Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi i Kina (2015CB942800), National Natural Science Foundation av Kina (31521004, 31471358 og 31522036) og støtte fra Peking-Tsinghua Center for biovitenskap til C.-R.X.
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
References
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the beta cell. Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).
- Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
- Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- . FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).
- Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
- Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).
- Hadley, W. . ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).
- . gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016)
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. , (2017).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).
