Быстрый, безопасный и простой ручной прикроватные нуклеиновой кислоты извлечения для обнаружения вируса в пробах цельной крови
Summary
Здесь мы представляем протокол для извлечения антивирусную нуклеиновой кислоты из цельной крови инактивированный вирус. Добыча осуществляется непосредственно в пробирки и не требует оборудования или электричество. Метод не зависит от лабораторных объектов и могут быть использованы в любом месте (например, в полевых госпиталях).
Abstract
Быстрая диагностика инфекции имеет важное значение для управления вспышки, сдерживание рисков и ухода за пациентами. Ранее мы показали метод для быстрого прикроватные инактивация вируса Эбола во время забора крови для безопасного нуклеиновой кислоты (NA) тестов, добавив коммерческих лизис/привязки буфера непосредственно в вакуумной пробирки. Используя этот подход прикроватные инактивации, мы разработали безопасного, быстрого и упрощенного метода прикроватные NA извлечения для последующего обнаружения вируса в крови целом инактивированная буфера lysis/привязки. NA добыча производится непосредственно в пробирки и не требует оборудования или электричество.
После того, как кровь собирается в буфере lysis/привязки, содержание смешиваются, щелкая трубки вручную, и смесь инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. Магнитные стекла частиц (MGPs) добавляются к трубе, и содержание смешиваются, щелкая трубки коллекции вручную. MGPs затем собираются на стороне пробирка с помощью магнита и магнитным держателем или резинкой. MGPs промывают три раза, и после добавления Элюирующий буфер непосредственно в коллекции трубку, NAs готовы для испытаний NA, например ПЦР или изотермический цикл амплификации (лампа), без удаления MGPs от реакции. Метод извлечения NA не зависит от каких-либо лабораторных объектов и могут быть легко использованы в любом месте (например, в полевые госпитали и больницы изоляторах). Когда этот метод извлечения NA сочетается с лампой и портативный инструмент, диагноз можно получить в течение 40 мин сбора крови.
Introduction
В ситуациях вспышки вируса когда пациенты сводятся к изоляции стационарах или когда требуется быстрый диагноз, безопасной, простой и точной точки обслуживания молекулярной диагностики является императивом для пациента ухода и риска сдерживания. Два недавних вспышек вирусных, вирус Эбола (EBOV) в Западной Африке (2013) и вирус Зика в Южной Америке (2015), повысили интерес к улучшение обслуживания точки молекулярных диагностических тестов, например обратная транскрипция цикла опосредованной изотермический амплификация (RT-лампа)1,2 и рекомбиназа полимеразы амплификации (РПА)3,4. RT-лампа и РПА, быстрое, чувствительной и конкретные молекулярные тесты, которые могут быть выполнены на упрощенный пример подготовки. Для вируса Зика RT-лампа была объединена с бокового потока проба (LFA), который может обнаружить вирус Зика проб неочищенных цельной крови в течение 30 мин-1; Однако, для EBOV, который классифицируется как риск группы 4 возбудителя и очень заразна, образцы необходимо обрабатывать по биобезопасности уровня 4 (BSL-4) условия и инактивированных перед любой безопасной диагностические процедуры могут быть выполнены.
Упрощенные инактивации методы для EBOV, такие как добавление лизис буферов для образца2,3,4,5, были использованы во время вспышки; Однако эти методы требуют обработки условиях BSL-4 с лабораторным оборудованием, например биобезопасности шкафы BSL-3, центрифуги, Отопление блоков и пипетки, как минимум. Это оборудование обычно не присутствует, в следственных изоляторах или в полевых госпиталях. Чтобы преодолеть эту проблему, были предприняты попытки для выполнения диагностики в чемоданах3, и несколько портативных устройств и машин были развитые [например, портативное устройство для извлечения нуклеиновой кислоты (NA)]6. Однако EBOV-позитивных образцов необходимо инактивированная, прежде чем эти устройства могут быть использованы.
Мы уже ранее сообщали метод инактивации антивирусную Тумба для EBOV7, Vaccinia вируса и вирус коровьей8 добавлением буфера коммерческих лизис/привязки для обычных вакуумной пробирки, позволяя для прямого Передача крови от пациента в инактивации буфера7. Это прямой и непосредственный инактивации в закрытой системе устраняет необходимость для обработки образцов с помощью любой строгий сдерживания, например BSL-4 условия7, и образцы могут быть обработаны при нормальных условиях BSL-2. Этот метод инактивации совместим с несколькими системами извлечения NA, таких как роботы и ручной очистки наборы7; Однако эти методы требуют лабораторного оборудования, таких как роботы, центрифуги и электричество, которые не всегда присутствуют в поле Параметры или внутри изоляции стационарах.
В настоящем докладе мы описываем безопасного, быстрого и упрощенного метода ручной NA извлечения для последующего молекулярной обнаружения вируса в крови целом инактивированная буфера lysis/привязки. Метод извлечения NA не требуют никакого оборудования помимо магнит/магнитный держатель. Нет центрифуги, Отопление блоков, или электричество необходимо для извлечения NA. Следовательно, этот метод не зависит от лабораторных объектов и могут быть легко использованы в любом месте (например, в полевых госпиталях, в стационарах изоляции, или с ограниченными ресурсами). Метод извлечения NA быстрый и простой и может использоваться непосредственно в любой течению NA тесты, такие как RT-лампа, лампа, ПЦР и RT-ПЦР. Когда этот метод извлечения NA сочетается с лампой и портативный аккумулятор driven изотермический инструмент, прикроватные диагноз можно получить в течение 40 мин сбора крови.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем докладе мы описываем безопасной, быстрой и простой ручной прикроватные NA извлечения метод для вниз по течению молекулярной обнаружения вируса в крови целом инактивированная буфера lysis/привязки. Описан метод извлечения NA был разработан непосредственно на пробах цельной кр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Сюзанна Лопес Расмуссен и Солвэй Kolbjørn Дженсен за их технической помощи и для обработки клинических образцов. Этот проект является частью EbolaMoDRAD консорциум, который получил финансирование от инновационной медицины инициатива 2 совместное предприятие под Грант соглашение N ° 115843. Это совместное предприятие получает поддержку от Европейского союза Horizon 2020 исследований и инновационной программы и EFPIA.
Materials
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. . Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).
- MPLC. . Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).
