Hurtig, sikker og simpel manuel sengelamper nukleinsyre udvinding til påvisning af Virus i blodprøver

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til hurtig virus nukleinsyre udvinding fra fuldblod virus-inaktiveret. Ekstraktionen udføres direkte i blodet indsamling rør og kræver ingen udstyr eller elektricitet. Metoden er ikke afhængige af laboratoriefaciliteter og kan anvendes overalt (f.eks.i felthospitaler).

Abstract

Hurtig diagnosticering af en infektion er afgørende for udbruddet forvaltning, risiko indeslutning og patientpleje. Vi har tidligere vist en metode til hurtig sengelamper inaktivering af Ebola virus under udtagning af blodprøve for sikker nukleinsyre (NA) test ved at tilføje en kommerciel lysis/binding buffer direkte i vakuum blod indsamling rør. Brug denne sengelamper inaktivering fremgangsmåde, har vi udviklet en sikker, hurtig og forenklet sengelamper NA ekstraktion metode til efterfølgende påvisning af virus i lysis/binding buffer-inaktiverede fuldblod. NA udvinding udføres direkte i blodet indsamling rør og kræver ingen udstyr eller elektricitet.

Når blodet er indsamlet i lysis/binding buffer, indholdet blandes ved at vende røret ved håndkraft, og blandingen er udruget i 20 min. ved stuetemperatur. Magnetisk glas partikler (FUP) er føjet til røret, og indholdet blandes ved at vende samling røret ved håndkraft. De flerårige udviklingsprogrammer er derefter indsamles på siden af blod samling røret ved hjælp af en magnetisk indehaveren eller en magnet og en elastik. De flerårige udviklingsprogrammer er vasket tre gange, og efter tilsætning af eluering buffer direkte i collection tube, NAs er klar til NA tests, såsom qPCR eller isotermisk loop forstærkning (lampe), uden fjernelse af FUP fra reaktionen. NA ekstraktion metode er ikke afhængig af nogen laboratoriefaciliteter og nemt kan anvendes overalt (f.eks.i felthospitaler og hospitalsafdelinger isolation). Når denne NA ekstraktion metode kombineres med lampe og en transportabel instrument, får en diagnose indenfor 40 min i samlingen blod.

Introduction

I virus udbrud situationer, når patienter er begrænset til isolation hospitalsafdelinger eller hvor der er behov for en hurtig diagnose, er en sikker, enkel og præcis punkt af pleje molekylære diagnose afgørende for den patient pleje og risiko indeslutning. De to seneste viral udbrud af Ebola virus (EBOV) i Vestafrika (2013) og Zika virus i Sydamerika (2015), har øget interessen for forbedret punkt af pleje Molekylær diagnostisk test, såsom reverse transkription loop-medieret isotermiske forstærkning (RT-lampe)^1,2 og recombinase-polymerase forstærkning (RPA)^3,4. Både RT-lampe og RPA er hurtige, følsomme og specifikke molekylære test, der kan udføres på forenklet prøve præparater. Zika virus, er RT-lampe blevet kombineret med en lateral flow analyse (LFA), der kan spore Zika virus i ikke renset hele blodprøver inden for 30 min¹; men for EBOV, der er klassificeret som en risiko gruppe 4 patogen og er meget smitsom, prøverne skal håndteres under biosikkerhed niveau 4 (BSL-4) betingelser og inaktiveret før nogen sikker diagnostiske procedurer kan udføres.

Forenklet inaktivering metoder til EBOV, såsom tilføjelsen af lysis buffere til prøve^2,3,4,5, blev brugt under udbrud. disse metoder kræver dog håndtering på BSL-4 betingelser med laboratorieudstyr, som BSL-3 biosikkerhed kabinetter, centrifuger, varme blokke og pipetter, på et minimum. Dette udstyr er normalt ikke til stede i isolation afdelinger eller i felthospitaler. For at overvinde denne udfordring, man har forsøgt at udføre diagnosticeringen i kufferter³og flere bærbare enheder og maskiner har været udviklet [f.eks.en bærbar enhed for nukleinsyre (NA) udvinding]⁶. Men EBOV-positive prøver stadig skal deaktiveres, før disse enheder kan bruges.

Vi har tidligere rapporteret en hurtig sengelamper virus inaktivering metode til EBOV⁷, Vaccinia virus og Cowpox virus⁸ ved tilsætning af en kommerciel lysis/binding buffer til almindelige vakuum blod indsamling rør, giver mulighed for direkte overførsel af blod fra patienten til inaktivering buffer⁷. Denne direkte og umiddelbar inaktivering i et lukket system eliminerer behovet for håndtering af prøver ved hjælp af en fuldkommen indeslutning, som BSL-4 betingelser⁷, og prøverne kan håndteres under normale BSL-2. Denne inaktivering metode er kompatibel med flere NA udvinding systemer, som robotter og hånd rensning kits⁷; disse metoder kræver dog laboratorieudstyr, som robotter, centrifuger og elektricitet, der ikke er altid til stede i Feltindstillinger eller inde i isolation hospitalsafdelinger.

I denne rapport beskriver vi en sikker, hurtig og forenklet manuel NA ekstraktion metode til efterfølgende molekylære påvisning af virus i lysis/binding buffer-inaktiverede fuldblod. NA ekstraktion metode kræver ikke noget udstyr end en magnet/magnetiske indehaveren. Ingen centrifuger, varme blokke eller elektricitet er nødvendig for NA udvinding. Derfor, denne metode er ikke afhængige af laboratoriefaciliteter og nemt kan anvendes overalt (f.eks.i felthospitaler, i isolation hospitalsafdelinger eller med lav-ressource-indstillinger). NA ekstraktion metode er hurtig og enkel og kan anvendes direkte i enhver downstream NA test, såsom qPCR, RT-qPCR, lampe eller RT-lampe. Når denne NA ekstraktion metode kombineres med lampe og en bærbar batteri-drevet isotermisk instrument, kan en bedside diagnose opnås indenfor 40 min i samlingen blod.

Protocol

Udvalget om biomedicinsk forskning etik og region hovedstaden har givet informeret samtykke, og alle metoder beskrevet her er fritaget fra en anmeldelse af etiske komité-systemet i overensstemmelse med den danske lov om assay udviklingsprojekter. 1. forberedelse af blod samling vakuumrør for Virus inaktivering og hurtige NA udvinding Advarsel: Den buffer, der bruges til denne protokol indeholder guanidinium kaliumthiocyanat (GITC) og en nonionisk overfladeaktivt sto…

Representative Results

Protokollen præsenteres her er enkle og effektive og kan anvendes bredt på enhver Molekylær analyse skal gennemføres på infektiøs hele blodprøver inaktiveres med lysis/binding buffer. Arbejdsgangen for blod inaktivering og NA udvinding er vist i figur 1, herunder udarbejdelse af blod samling vakuumrør7 (figur 1A), blod samling7 (figur 1B), NA ud…

Discussion

I denne rapport beskriver vi en sikker, hurtig og enkel manuel sengelamper NA ekstraktion metode til downstream molekylære påvisning af virus i lysis/binding buffer-inaktiverede fuldblod. Metoden beskrevet NA udvinding blev udviklet udføres direkte på hele blodprøver indsamlet i vakuum blod indsamling rør indeholdende lysis/binding buffer (Table of Materials)⁷. Denne specifikke buffer inaktiverer EBOV⁷ og det kritiske element i metoden. Efter samlinge…

Materials

Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)	Becton Dickinson	368861
Plus Blood Collection	Becton Dickinson	362725
23G x 1 needle	Becton Dickinson	300800
LUER LOK syringe (3 mL)	Becton Dickinson	309658
Butterfly needle with small-bore extension tubing	Jørgen Kruuse A/S	121714
1% Virkon	Nomeco A/S	849265
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill	Roche Diagnostics A/S	03246752001
MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit	Roche Diagnostics A/S	3038505001
Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)	Thermo Fisher Scientific	375418
Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)	Thermo Fisher Scientific	379189
Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL)	Thermo Fisher Scientific	379146
DynaMag™-5 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12303D
Transfer pipette (3.5 mL)	Sarstedt	86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL)	Thermo Fisher Scientific	231
Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652