Vi præsenterer her, en protokol til hurtig virus nukleinsyre udvinding fra fuldblod virus-inaktiveret. Ekstraktionen udføres direkte i blodet indsamling rør og kræver ingen udstyr eller elektricitet. Metoden er ikke afhængige af laboratoriefaciliteter og kan anvendes overalt (f.eks.i felthospitaler).
Hurtig diagnosticering af en infektion er afgørende for udbruddet forvaltning, risiko indeslutning og patientpleje. Vi har tidligere vist en metode til hurtig sengelamper inaktivering af Ebola virus under udtagning af blodprøve for sikker nukleinsyre (NA) test ved at tilføje en kommerciel lysis/binding buffer direkte i vakuum blod indsamling rør. Brug denne sengelamper inaktivering fremgangsmåde, har vi udviklet en sikker, hurtig og forenklet sengelamper NA ekstraktion metode til efterfølgende påvisning af virus i lysis/binding buffer-inaktiverede fuldblod. NA udvinding udføres direkte i blodet indsamling rør og kræver ingen udstyr eller elektricitet.
Når blodet er indsamlet i lysis/binding buffer, indholdet blandes ved at vende røret ved håndkraft, og blandingen er udruget i 20 min. ved stuetemperatur. Magnetisk glas partikler (FUP) er føjet til røret, og indholdet blandes ved at vende samling røret ved håndkraft. De flerårige udviklingsprogrammer er derefter indsamles på siden af blod samling røret ved hjælp af en magnetisk indehaveren eller en magnet og en elastik. De flerårige udviklingsprogrammer er vasket tre gange, og efter tilsætning af eluering buffer direkte i collection tube, NAs er klar til NA tests, såsom qPCR eller isotermisk loop forstærkning (lampe), uden fjernelse af FUP fra reaktionen. NA ekstraktion metode er ikke afhængig af nogen laboratoriefaciliteter og nemt kan anvendes overalt (f.eks.i felthospitaler og hospitalsafdelinger isolation). Når denne NA ekstraktion metode kombineres med lampe og en transportabel instrument, får en diagnose indenfor 40 min i samlingen blod.
I virus udbrud situationer, når patienter er begrænset til isolation hospitalsafdelinger eller hvor der er behov for en hurtig diagnose, er en sikker, enkel og præcis punkt af pleje molekylære diagnose afgørende for den patient pleje og risiko indeslutning. De to seneste viral udbrud af Ebola virus (EBOV) i Vestafrika (2013) og Zika virus i Sydamerika (2015), har øget interessen for forbedret punkt af pleje Molekylær diagnostisk test, såsom reverse transkription loop-medieret isotermiske forstærkning (RT-lampe)1,2 og recombinase-polymerase forstærkning (RPA)3,4. Både RT-lampe og RPA er hurtige, følsomme og specifikke molekylære test, der kan udføres på forenklet prøve præparater. Zika virus, er RT-lampe blevet kombineret med en lateral flow analyse (LFA), der kan spore Zika virus i ikke renset hele blodprøver inden for 30 min1; men for EBOV, der er klassificeret som en risiko gruppe 4 patogen og er meget smitsom, prøverne skal håndteres under biosikkerhed niveau 4 (BSL-4) betingelser og inaktiveret før nogen sikker diagnostiske procedurer kan udføres.
Forenklet inaktivering metoder til EBOV, såsom tilføjelsen af lysis buffere til prøve2,3,4,5, blev brugt under udbrud. disse metoder kræver dog håndtering på BSL-4 betingelser med laboratorieudstyr, som BSL-3 biosikkerhed kabinetter, centrifuger, varme blokke og pipetter, på et minimum. Dette udstyr er normalt ikke til stede i isolation afdelinger eller i felthospitaler. For at overvinde denne udfordring, man har forsøgt at udføre diagnosticeringen i kufferter3og flere bærbare enheder og maskiner har været udviklet [f.eks.en bærbar enhed for nukleinsyre (NA) udvinding]6. Men EBOV-positive prøver stadig skal deaktiveres, før disse enheder kan bruges.
Vi har tidligere rapporteret en hurtig sengelamper virus inaktivering metode til EBOV7, Vaccinia virus og Cowpox virus8 ved tilsætning af en kommerciel lysis/binding buffer til almindelige vakuum blod indsamling rør, giver mulighed for direkte overførsel af blod fra patienten til inaktivering buffer7. Denne direkte og umiddelbar inaktivering i et lukket system eliminerer behovet for håndtering af prøver ved hjælp af en fuldkommen indeslutning, som BSL-4 betingelser7, og prøverne kan håndteres under normale BSL-2. Denne inaktivering metode er kompatibel med flere NA udvinding systemer, som robotter og hånd rensning kits7; disse metoder kræver dog laboratorieudstyr, som robotter, centrifuger og elektricitet, der ikke er altid til stede i Feltindstillinger eller inde i isolation hospitalsafdelinger.
I denne rapport beskriver vi en sikker, hurtig og forenklet manuel NA ekstraktion metode til efterfølgende molekylære påvisning af virus i lysis/binding buffer-inaktiverede fuldblod. NA ekstraktion metode kræver ikke noget udstyr end en magnet/magnetiske indehaveren. Ingen centrifuger, varme blokke eller elektricitet er nødvendig for NA udvinding. Derfor, denne metode er ikke afhængige af laboratoriefaciliteter og nemt kan anvendes overalt (f.eks.i felthospitaler, i isolation hospitalsafdelinger eller med lav-ressource-indstillinger). NA ekstraktion metode er hurtig og enkel og kan anvendes direkte i enhver downstream NA test, såsom qPCR, RT-qPCR, lampe eller RT-lampe. Når denne NA ekstraktion metode kombineres med lampe og en bærbar batteri-drevet isotermisk instrument, kan en bedside diagnose opnås indenfor 40 min i samlingen blod.
I denne rapport beskriver vi en sikker, hurtig og enkel manuel sengelamper NA ekstraktion metode til downstream molekylære påvisning af virus i lysis/binding buffer-inaktiverede fuldblod. Metoden beskrevet NA udvinding blev udviklet udføres direkte på hele blodprøver indsamlet i vakuum blod indsamling rør indeholdende lysis/binding buffer (Table of Materials)7. Denne specifikke buffer inaktiverer EBOV7 og det kritiske element i metoden. Efter samlinge…
The authors have nothing to disclose.
Vi takke Susanne Lopes Rasmussen og Solvej Kolbjørn Jensen for deres tekniske bistand og for håndtering af kliniske prøver. Dette projekt er en del af EbolaMoDRAD-konsortiet, der har modtaget støtte fra det nyskabende medicin initiativ 2 fælles tilsagn under grant aftale N ° 115843. Dette fællesforetagende modtager støtte fra EUs Horisont 2020 forskning og innovation program og EFPIA.
Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |