Rapido, sicuro e semplice manuale sul comodino estrazione dell'acido nucleico per la rilevazione del Virus in campioni di sangue intero
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l’estrazione dell’acido nucleico rapido virus dal sangue intero virus-inattivato. L’estrazione viene eseguita direttamente nei tubi di raccolta sangue e non richiede attrezzature o elettricità. Il metodo non è dipendente da strutture di laboratorio e può essere utilizzato ovunque (ad esempio, in ospedali da campo).
Abstract
La diagnosi rapida di un’infezione è essenziale per la gestione di scoppio, contenimento del rischio e cura del paziente. Precedentemente abbiamo indicato un metodo per la rapida comodino inattivazione del virus dell’Ebola durante il prelievo di sangue per i test di sicurezza dell’acido nucleico (NA) con l’aggiunta di un buffer di lisi/associazione commerciale direttamente nei tubi di raccolta del sangue di vuoto. Utilizzando questo approccio di inattivazione comodino, abbiamo sviluppato un sicuro, rapido e semplificato sul comodino NA metodo di estrazione per il successivo rilevamento di un virus nel sangue intero inattivato di buffer di lisi/associazione. L’estrazione di NA avviene direttamente nei tubi di raccolta sangue e non richiede alcuna attrezzatura o elettricità.
Dopo il sangue viene raccolto nel buffer di lisi/associazione, i contenuti sono mescolati girando a mano il tubo e la miscela viene incubata per 20 min a temperatura ambiente. Particelle di vetro magnetico (MGPs) vengono aggiunti al tubo, e il contenuto è mescolato girando a mano il tubo di raccolta. I pop sono poi raccolti sul lato del tubo di raccolta sangue usando un supporto magnetico o un magnete e un elastico. Il MGPs vengono lavati tre volte, e dopo l’aggiunta di tampone di eluizione direttamente nel tubo di raccolta, il NAs è pronto per i test di NA, quali qPCR o amplificazione isotermica loop (lampada), senza la rimozione di MGPs dalla reazione. Il metodo di estrazione NA non è dipendente da qualsiasi strutture di laboratorio e può essere facilmente utilizzato ovunque (ad esempio, in ospedali da campo e reparti ospedalieri isolamento). Quando questo metodo di estrazione del NA è combinato con la lampada e uno strumento portatile, una diagnosi può essere ottenuta entro 40 min della raccolta sangue.
Introduction
In epidemie di virus, quando i pazienti sono limitati per i reparti di isolamento dell’ospedale o quando è necessaria una diagnosi veloce, sicura, semplice ed accurata diagnosi molecolare point-of-care è di importanza fondamentale per il contenimento di cura e rischio paziente. I due recenti focolai virali, del virus dell’Ebola (EBOV) in Africa occidentale (2013) e il virus di Zika in Sud America (2015), hanno aumentato l’interesse per migliorato point-of-care test diagnostici molecolari, come ad esempio isotermica mediata da loop trascrizione inversa amplificazione (RT-LAMP)1,2 e ricombinasi polimerasi amplificazione (RPA)3,4. RPA e RT-lampada sono rapidi, sensibili e specifici test molecolari che possono essere eseguite sui preparativi di esempio semplificato. Per il virus di Zika, RT-LAMP è stato combinato con un’analisi di flusso laterale (LFA), in grado di rilevare virus di Zika in campioni di sangue intero di non purificate entro 30 min1; Tuttavia, per EBOV, che è classificato come agente patogeno del gruppo 4 di rischio ed è altamente contagiosa, i campioni devono essere gestite sotto biosicurezza 4 (BSL-4) condizioni di livello e inattivati prima di possono eseguire qualsiasi sicuro procedure diagnostiche.
Metodi di inattivazione semplificata per EBOV, come l’aggiunta di buffer di lisi per il campione2,3,4,5, sono stati usati durante lo scoppio; Tuttavia, questi metodi richiedono una gestione in condizioni di BSL-4 con apparecchiature di laboratorio, quali biosicurezza BSL-3, centrifughe, blocchi di riscaldamento e pipette, come minimo. Questa apparecchiatura normalmente non è presente nei reparti di isolamento o in ospedali da campo. Per superare questa sfida, sono stati tentativi di eseguire la diagnostica in valigie3, e diversi dispositivi portatili e le macchine sono state sviluppate [ad esempio, un dispositivo portatile per estrazione di acidi nucleici (NA)]6. Tuttavia, i campioni positivi EBOV devono ancora essere inattivati prima che questi dispositivi possono essere utilizzati.
Precedentemente abbiamo segnalato un metodo di inattivazione rapida virus sul comodino per il EBOV7e la Vaccinia virus del Cowpox virus8 tramite l’aggiunta di un buffer di lisi/associazione commerciale in provette di raccolta del sangue di vuoto ordinario, consentendo per la diretta trasferimento di sangue dal paziente nel buffer inattivazione7. Questa inattivazione diretta e immediata in un sistema chiuso Elimina la necessità di gestire i campioni utilizzando qualsiasi contenimento rigoroso, ad esempio BSL-4 condizioni7, e i campioni possono essere gestiti in condizioni normali di BSL-2. Questo metodo di inattivazione è compatibile con diversi sistemi di estrazione di NA, come robot e mano purificazione Kit7; Tuttavia, questi metodi richiedono apparecchiature di laboratorio, come robot, centrifughe e l’elettricità, che non sono sempre presenti nel campo impostazioni o all’interno di reparti ospedalieri isolamento.
In questo rapporto, descriviamo un sicuro, rapido e semplificato NA estrazione metodo manuale per la successiva rilevazione molecolare di un virus nel sangue intero inattivato di buffer di lisi/associazione. Il metodo di estrazione NA non richiede attrezzature diverse da un supporto magnetico/magnetico. Nessun centrifughe, riscaldamento isolati, o energia elettrica sono necessari per l’estrazione di NA. Quindi, questo metodo non è dipendente da strutture di laboratorio e può essere facilmente utilizzato ovunque (ad esempio, in ospedali da campo, in reparti ospedalieri di isolamento o con impostazioni di risorse limitate). Il metodo di estrazione del NA è rapida e semplice e può essere utilizzato direttamente in qualsiasi test NA a valle, quali qPCR, RT-qPCR, lampada o RT-LAMP. Quando questo metodo di estrazione del NA è combinato con uno strumento portatile a batteria isotermico e lampada, una comodino diagnosi possono essere ottenuta in 40 min della raccolta sangue.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo rapporto, descriviamo un sicuro, rapido e semplice manuale sul comodino NA metodo di estrazione per la rilevazione molecolare a valle di un virus nel sangue intero inattivato di buffer di lisi/associazione. Il metodo di estrazione NA descritto è stato sviluppato per essere eseguito direttamente su campioni di sangue intero raccolti in provette sottovuoto contenente la lisi/binding buffer (Tabella materiali)7. Questo buffer specifico inattiva EBOV7</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Susanne Lopes Rasmussen e Solvej Kolbjørn Jensen per la loro assistenza tecnica e per la gestione dei campioni clinici. Questo progetto fa parte del Consorzio EbolaMoDRAD, che ha fruito di un finanziamento innovativo medicina iniziativa 2 impresa comune sotto concessione contratto N ° 115843. Questa impresa comune riceve supporto da EFPIA e programma di innovazione e ricerca Orizzonte 2020 dell’Unione europea.
Materials
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
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