전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출
Summary
여기, 우리는 바이러스 비활성화 전체 혈액에서 급속 한 바이러스 핵 산 추출에 대 한 프로토콜을 제시. 추출 혈액 컬렉션 튜브에 직접 수행 되 고 필요 없는 장비 또는 전기. 방법과 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 수 있습니다 어디서 나 (예를 들어, 필드 병원에서) 사용.
Abstract
감염의 급속 한 진단 발발 관리, 위험 봉쇄, 그리고 환자 치료를 위해 필수적 이다. 우리 이전 진공 혈액 컬렉션 튜브에 직접 상업 세포/바인딩 버퍼를 추가 하 여 안전한 핵 산 (나) 테스트를 위한 혈액 샘플링 동안 에볼라 바이러스의 급속 한 머리 맡 비활성화 하는 방법을 나타났습니다. 이 침대 비활성화 접근을 사용 하 여, 신속, 안전 하 고 단순화 된 머리 맡 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 검색에 대 한 개발 했습니다. 나 추출 혈액 컬렉션 튜브에서 직접 수행 하 고 아무 장비 또는 전기를 요구 한다.
혈액 세포/바인딩 버퍼에 수집 후 내용을 손으로 튜브를 틀 지 하 여 혼합 하 고 혼합물은 실 온에서 20 분 동안 알을 품을. 자석 유리 입자 (MGPs) 튜브에 추가 되 고 내용을 손으로 컬렉션 튜브를 틀 지 하 여 혼합 됩니다. MGPs는 다음 자석 홀더 또는 자석 및 고무 밴드를 사용 하 여 혈액 컬렉션 튜브 측에 수집 됩니다. MGPs는 세 번 씻어 그리고 컬렉션 튜브에 직접 차입 버퍼의 추가, NAs 나 테스트, 정량 등의 반응에서 MGPs 제거 없이 등온선 루프 증폭 (램프)에 대 한 준비가. 나 추출 메서드는 모든 실험실 시설에 의존 하지 않으며 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원 및 병원 격리 병 동에서) 어디서 나 사용할. 이 나 추출 방법은 램프 및 휴대용 악기와 결합 하면 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.
Introduction
바이러스 발생 상황에서 환자 병원 격리 병 동 또는 때 빠른 진단이 필요 하 고에 수감 되는 때, 간단 하 고, 안전 하 고 정확한 포인트의 케어 분자 진단 환자 관리 및 위험 포함에 대 한 필수적입니다. 에볼라 바이러스 (EBOV) 서 부 아프리카 (2013) 및 남미 (2015), Zika 바이러스의 2 개의 최근 바이러스 발생, 향상 된 관리 포인트 분자 진단 테스트, 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 등에 대 한 관심 증가 증폭 (RT-램프)1,2 , recombinase 중 합 효소 증폭 (RPA)3,4. RT-램프와 RPA는 단순화 된 샘플 준비에 수행할 수 있는 빠른, 민감한, 그리고 특정 분자 테스트. Zika 바이러스에 대 한 실시간 램프는 측면 흐름 분석 결과 (LFA), 30 분1; 내 정화 비 전체 혈액 샘플에서 Zika 바이러스를 검출할 수 있는 결합 되었습니다. 그러나, 위험 그룹 4 병원 체로 분류 되는 매우 전염성이 EBOV 샘플 biosafety 아래 처리 될 필요 레벨 4 (BSL-4) 조건 및 안전 진단 절차를 수행할 수 있습니다 전에 비활성화.
단순화 된 비활성화 방법 EBOV, 샘플2,3,,45에 세포의 용 해 버퍼의 추가 같은 발발; 하는 동안 사용 되었다 그러나, 이러한 방법을 BSL-3 biosafety 캐비닛, 원심 분리기, 난방 블록 및 펫, 최소한 같은 실험실 장비와 BSL-4 조건 하에서 처리를 해야합니다. 이 장비는 격리 병 동에 또는 필드 병원에 일반적으로 존재. 이 문제를 해결 하려면 시도에 가방3, 진단 수행 되었습니다 되며 여러 휴대용 장치 및 기계 개발 [예를 들어, (나) 핵 산 추출에 대 한 휴대용 장치]6. 그러나, EBOV 긍정적인 샘플 여전히이 장치를 사용할 수 있습니다 비활성화 될 필요 합니다.
우리가 이전에 보고 된 EBOV7, Vaccinia 바이러스 및 Cowpox 바이러스8 에 대 한 신속한 머리 맡 바이러스 비활성화 방법 상업 세포/바인딩 버퍼의 추가 의해 일반 진공 혈액 컬렉션 튜브를 직접 허용 양도 혈액 환자에서 비활성화 버퍼7에. 어떤 엄격한 봉쇄, BSL-4 조건7, 등을 사용 하 여 샘플 처리에 대 한 필요성을 제거 하는 닫힌된 시스템에서이 직접적이 고 즉각적인 비활성화 하 고 샘플 정상적인 BSL-2 조건 하에서 처리 될 수 있습니다. 이 비활성화 방법은 여러 나 추출 시스템, 로봇 등 손 정화 키트7;와 호환 그러나, 이러한 방법은 항상 병원 격리 병 동 내부 또는 필드 설정에 존재 하지 않는 로봇, 원심 분리기, 전기, 등 실험실 장비가 필요 합니다.
이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 단순화 된 수동 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 분자 검출에 대 한 설명합니다. 나 추출 방법에는 어떤 장비의 자석/자석 홀더 필요 하지 않습니다. 아니 원심 분리기, 블록, 또는 전기 난방 나 추출 필요 합니다. 따라서,이 방법은 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 하 고 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원, 병원 격리 병 동, 또는 낮은 리소스 설정을) 어디서 나 사용할. 나 추출 방법 신속 하 고 간단 하 고 모든 다운스트림 나 테스트, 정량, 실시간 정량, 램프, 또는 RT 램프 등에서 직접 사용할 수 있습니다. 이 나 추출 방법은 램프와 휴대용 배터리 구동 등온선 악기와 결합 하면 머리 맡 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 간단한 수동 침대 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 다운스트림 분자 검출에 대 한 설명합니다. 직접 세포/바인딩 버퍼 (자료 테이블)7를 포함 하는 진공 혈액 컬렉션 튜브에 수집 된 전체 혈액 샘플에 수행 되어야 할 설명된 나 추출 방법 개발 되었다. 이 특정 버퍼 EBOV7 생긴…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
그들의 기술 지원 및 임상 샘플 처리에 대 한 우리 감사 수잔 달리기 라 스무 센 및 Solvej Kolbjørn 젠 슨. 이 프로젝트는 혁신적인 의학 이니셔티브 2 공동 사업 보조금 계약 N ° 115843 아래에서 자금을 받고 있다 EbolaMoDRAD 컨소시엄의 일부입니다. 이 공동 사업 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 EFPIA에서 지원을 받습니다.
Materials
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
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