Snabb, säker och enkel manuell sängkanten nukleinsyra extraktion för påvisande av Virus i helblod
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för snabb virus nukleinsyra utvinning från den virus-inaktiverat helblod. Utvinning sker i blod insamling rören och kräver ingen utrustning eller elektricitet. Metoden är inte beroende av laboratorier och kan användas var som helst (t.ex., i fältsjukhus).
Abstract
Snabb diagnos av infektion är viktigt för utbrott management, risk inneslutning och patientvård. Vi har tidigare visat en metod för snabb bedside inaktivering av Ebolavirus under blodprovstagning för säker nukleinsyra (NA) tester genom att lägga till en kommersiell lysis/bindande buffert direkt in i vakuum blod insamling rören. Använder detta sängkanten inaktivering tillvägagångssätt, har vi utvecklat en säker, snabb och förenklad sängkanten NA utvinning metod för efterföljande detektion av virus i Lys/bindande buffert-inaktiverat helblod. NA extraktion utförs direkt i blod insamling rören och kräver ingen utrustning eller elektricitet.
När blodet samlas in i Lys/bindande bufferten, innehållet blandas genom att vrida röret för hand och blandningen inkuberas i 20 min i rumstemperatur. Magnetiska glas partiklar (FUP) läggs till röret, och innehållet blandas genom att vända samling röret för hand. De fleråriga utvecklingsprogrammen samlas sedan vid sidan av den bloduppsamlingsrör med hjälp av en magnetisk hållare eller en magnet och ett gummiband. De fleråriga utvecklingsprogrammen tvättas tre gånger och efter tillägg av eluering buffert direkt in i samling röret, NAs är redo för NA tester, såsom qPCR eller isotermiska loop amplifiering (lampa), utan avlägsnande av de fleråriga utvecklingsprogrammen från reaktionen. Den NA utvinning metoden är inte beroende av någon laboratorieresurser och lätt kan användas var som helst (t.ex., i fältsjukhus och vårdrum isolering). När denna NA extraktionen metod kombineras med lampa och ett bärbart instrument, kan en diagnos erhållas inom 40 min av blodinsamling.
Introduction
I virus utbrottssituationer, när patienter är begränsade till sjukhusavdelningar isolering eller när en snabb diagnos behövs, är en säker, enkel och korrekt point-of-care molekylär diagnos viktigt för patientens vård och risk inneslutning. De två senaste viral utbrott, Ebola-viruset (EBOV) i västra Afrika (2013) och zikaviruset i Sydamerika (2015), har ökat intresset för förbättrad point-of-care molekylär diagnostiska tester, såsom omvänd Transkription loop-medierad isotermiska förstärkning (RT-lampa)1,2 och recombinase polymeras amplifiering (RPA)3,4. Både RT-lampa och RPA är snabb, känsliga och specifika molekylära tester som kan utföras på förenklat prov preparat. För zikaviruset, har RT-lampa kombinerats med en lateral flow-analys (LFA), som kan upptäcka zikavirus i icke-renat hela blodprov inom 30 min1; för EBOV, som är klassificerat som en risk grupp 4 patogen och är mycket smittsam, proverna måste dock hanteras under biosäkerhet nivå 4 (BSL-4) villkor och inaktiverat innan några säkra diagnostiska procedurer kan utföras.
Förenklade inaktivering metoder för EBOV, såsom tillägg av Lys buffertar till prov2,3,4,5, användes under utbrottet; dessa metoder kräver dock hantering BSL-4 villkor med laboratorieutrustning, till exempel BSL-3 biosäkerhet skåp, centrifuger, värmeblocken pipetter, minst. Denna utrustning finns normalt inte i isolering vårdavdelningar eller ute i fältsjukhus. För att övervinna denna utmaning, försök har gjorts att utföra diagnostik i resväskor3, och flera bärbara enheter och maskiner har varit utvecklade [e.g., en bärbar enhet för extraktion av nukleinsyra (NA)]6. EBOV-positiva prover behöver dock fortfarande inaktiveras innan dessa enheter kan användas.
Vi har tidigare rapporterat en snabb bedside virus inaktivering metod för EBOV7, vacciniavirus och Cowpox virus8 genom tillsats av en kommersiell lysis/bindande buffert till vanliga vakuum blod insamling rör, möjliggör direkt överföring av blod från patienten till den inaktivering buffer7. Detta direkt och omedelbar inaktivering i ett stängt system eliminerar behovet av hantering av proverna med någon fullständig inneslutning, såsom BSL-4 villkor7, och proverna kan hanteras under normala BSL-2. Denna inaktivering metod är kompatibel med flera NA utvinning system, såsom robotar och hand rening kit7; dessa metoder kräver dock laboratorieutrustning, som robotar, centrifuger och el, som inte alltid finns i Fältinställningar eller inuti isolering sjukhusavdelningar.
I den här rapporten beskriver vi en säker, snabb och förenklad manuell NA utvinning metod för efterföljande molekylär påvisande av virus i Lys/bindande buffert-inaktiverat helblod. Den NA utvinning metoden kräver inte någon utrustning än en magnet/magnetiska hållare. Ingen centrifuger, värme block, eller el behövs för NA utvinning. Därför, denna metod är inte beroende av laboratorier och lätt kan användas var som helst (t.ex., i fältsjukhus, i isolering sjukhusavdelningar eller med resurssnål inställningar). NA utvinning metoden är snabb och enkel och kan användas direkt i någon nedströms NA tester, såsom qPCR, RT-qPCR, lampa eller RT-lampa. När denna NA extraktionen metod kombineras med lampa och en bärbar batteridriven isotermiska instrument, kan en bedside diagnos erhållas inom 40 min av blodinsamling.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här rapporten beskriver vi en säker, snabb och enkel manuell sängkanten NA utvinning metod för nedströms molekylär påvisande av virus i Lys/bindande buffert-inaktiverat helblod. Den beskrivna NA utvinning metoden utvecklades för att utföras direkt på helblod prov som samlats i vakuum blod insamling rör som innehåller Lys/bindande buffert (Tabell för material)7. Denna specifika buffert inactivates EBOV7 och är en kritisk komponent i metod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Susanne Lopes Rasmussen och Solvej Kolbjørn Jensen för deras tekniskt bistånd och för hantering av kliniska prover. Detta projekt är en del av konsortiet EbolaMoDRAD, som har fått stöd från de innovativa läkemedel 2 gemensamma företaget för initiativet under grant avtalet N ° 115843. Detta gemensamma företag får stöd från EU: s Horizon 2020 forsknings- och innovationsprogrammet- och EFPIA.
Materials
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. . Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).
- MPLC. . Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).
