Tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) amplifikasyon ve sıralama tek, tam uzunlukta (sağlam ve arızalı) HIV-1 proviruses yakınındaki bir verimli ve yüksek işlem hacmi yöntemi sağlar ve potansiyellerini belirlenmesi için izin verir çoğaltma-yetkinlik. DÖNDÜRÜR önceki deneyleri gizli HIV-1 rezervuar sıralamak için tasarlanmış sınırlamalar üstesinden gelir.
Full-Length bireysel Proviral sıralama (döndürür) tahlil ve tam uzunlukta (sağlam ve arızalı), HIV-1 proviruses tek sıra yükseltmek için tasarlanmış verimli ve yüksek işlem hacmi bir yöntemdir. DÖNDÜRÜR sağlar entegre HIV-1 bir hücre nüfus içinde genetik kompozisyon belirlenmesi. Büyük iç silme gibi ters Transkripsiyon sırasında ortaya çıkan HIV-1 proviral dizileri içinde kusurları tespit yoluyla zararlı stop kodon/Hipermutasyon, frameshift mutasyonlar ve mutasyonlar/silme öğeleri hareket CIS içinde gerekli virion olgunlaşma için FLIPS entegre proviruses çoğaltılması aciz tanımlayabilirsiniz. FLIPS tahlil bu kusurları eksikliği ve bu nedenle potansiyel olarak çoğaltma yetkili olan HIV-1 proviruses tanımlamak için yararlı olabilir. FLIPS Protokolü içerir: lizis HIV-1 enfekte hücre, PCR, tam uzunlukta HIV-1 proviruses iç içe (HIV-1 5’e hedef primerler kullanılarak ‘ 3’soldan sağa), DNA arıtma ve miktar, Kütüphane hazırlık için yeni nesil sekanslama (NGS), NGS, proviral contigs ve basit bir işlem çoğaltma yetkili proviruses tanımlamak için eleme de novo kurul. DÖNDÜRÜR sağlar sıra için tasarlanmış geleneksel yöntemleri üzerinde avantajları tek proviral sıralama gibi HIV-1 proviruses entegre. DÖNDÜRÜR güçlendirir ve kararlı olmak çoğaltma yetkinlik etkinleştirme tam uzunlukta proviruses dizileri ve aynı zamanda daha az sayıda amplifikasyon astar astar uyuşmazlıkları sonuçlarının önlenmesi, kullanır. FLIPS özellikle gizli rezervuar içinde entegre HIV-1 proviruses genetik peyzaj anlamak için yararlı bir araçtır, ancak, onun kullanımı herhangi bir uygulama için tümleşik HIV-1’in genetik kompozisyon gereklidir genişletebilirsiniz.
Uzun vadeli antiretroviral tedavi (ART) bireylerde devam ederse, gizli HIV-1 depo, genetik karakterizasyonu entegre proviruses çoğunluğu1 arızalı ve çoğaltma-beceriksiz olduğunu anlamak için çok önemli olmuştur , 2. Ters transkripsiyon işlemi sırasında hatalar entegre proviral sıra tanıtılmaktadır. Arızalı proviral dizileri oluşturmak bazı mekanizmalar hataya dahil HIV-1 ters transkriptaz enzimi3,4ve/veya APOBEC kaynaklı Hipermutasyon5,6anahtarlama şablonu. İki son yıllarda yapılan çalışmalarda bulduk izole bireyler üzerinde uzun vadeli ART HIV-1 proviruses yaklaşık % 5’i genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma yetkili ve HIV-1 plazma düzeyleri sanat kesilmesi üzerine hızlı rebound için katkıda bulunabilir 1 , 2 , 7. önceki çalışmalar çoğaltma yetkili HIV-1 proviruses saf ve bellek CD4 dinlenme inat belirledik+ T hücre önemini gösteren alt kümeleri, (orta, geçiş ve efektör bellek T hücreleri de dahil olmak üzere) Bunlar hedefleme gelecekte giderme stratejileri2,8,9hücreleri.
Dağıtım, dinamikleri ve gizli HIV-1 rezervuar bakım erken anlayışlar genetik olarak HIV-1 genom10 alt genomik bölgeleri karakterize tek proviral sıralama (SPS) yöntemleri kullanımı elde edildi ,11,12,13. SPS bir tek HIV-1 provirus üzerinden tek bir virüslü hücrede bulunan sıra için çok yönlü bir araçtır. Ancak, SPS sadece astar bağlayıcı siteleri içinde büyük silme işlemlerini içeren alt genomik bölgeler ve özlüyor proviruses dizileri beri proviruses, çoğaltma yetkinlik belirleyemiyor. Bir önceki çalışma SPS tarafından çoğaltma yetkili rezervuar boyutunu overestimates göstermiştir 13 – için 17 – kat seçici sağlam alt genomik bölgeler2sıralama yoluyla.
SPS, Ho ve ark. sınırlamaları gidermek için 4 ve Bruner vd. 1 deneyleri sıra tam uzunlukta HIV-1 proviruses yakınındaki geliştirdi. Bu genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma-yetkili, HIV-1 proviruses sıklığını tespit edilecek uzun vadeli sanat bireylerde izin verdi. Bu deneyleri ve güçlendirilmiş sıralı (Sanger üzerinden sıralama) sonra (olduğu gibi veya serisini arızalı) HIV-1 provirus elde etmek için toplandı alt genomik bölgeler. Bu yaklaşımın üç sınırlamalar şunlardır: 1) birden fazla sıralama astar kullanımı istemeden kusurları proviral dizisi tanıtımı riskini artırır, 2) astar uyuşmazlıkları amplifikasyon engelleyebilir belirli proviruses ve 3) genellikle Tüm proviral sıra bu yöntemler teknik nedeniyle çözümlenemiyor.
Varolan tam uzunlukta HIV-1 proviral sıralama deneyleri sınırlamalarını aşmak için Full –Lmesafe benkaynaklandığıdır Proviral Sequencing (döndürür) tahlil geliştirilmiştir. DÖNDÜRÜR bir nesil sıralama (NGS) olduğunu-hangi güçlendirir ve yüksek üretilen iş ve verimli bir şekilde tam uzunlukta (sağlam ya da bozuk) HIV-1 proviruses serileri temel alınarak tahlil. FLIPS kullanılan astar sayısını sınırlar gibi önceki deneyleri, avantajlar sağlar; Bu nedenle, proviruses nüfusu sınırlayabilir uyuşmazlıkları yakalanan ya da istemeden kusurları bir viral dizisi tanıştırmak astar olasılığını azaltır. DÖNDÜRÜR aynı zamanda daha az teknik olarak önceki deneyleri meydan okuyor ve 6 ana adımlardan oluşur: 1) lizis HIV-1 enfekte hücreleri, 2) tek HIV-1 proviruses yolu ile iç içe geçmiş PCR seyreltme için son derece korunmuş astar özel kullanarak sınırlama gerçekleştirilen amplifikasyon HIV-1 5′ ve 3′ U5 LTR bölge (Şekil 1A), 3) arıtma ve miktar güçlendirilmiş ürünler, 4) güçlendirilmiş proviruses Kütüphane hazırlanması için NGS, 5) NGS ve 6) contigs her elde etmek için sıralı proviruses Meclisi de novo tek tek provirus.
FLIPS tarafından oluşturulan dizileri o hangi genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma yetkili (Şekil 1 c)2tanımlamak için eleme sıkı bir süreç tabi olabilir. Genetik olarak olduğu gibi proviruses da bir çoğaltma-beceriksiz provirus üretimi neden tüm bilinen hataları eksikliği. Bu kusurlar dahil: inversiyon dizileri, büyük iç silme, Hipermutasyon/zararlı stop kodon, frameshifts veya mutasyonların 5 sinyal veya ana ambalaj ‘ splice donör (MSD) sitesi.
Şekil 1: tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) tahlil önemli adımlar. (A)HIV-1 DNA genom astar bağlayıcı siteleri tam uzunlukta (kusurlu ve sağlam) HIV-1 proviruses iç içe geçmiş PCR ile yakınındaki yükseltmek için FLIPS tarafından kullanılan 5′ ve 3′ U5 LTR bölgelerinde ile. (B) yerleşimini 80 örnek wells (20 kuyu her seyreltme için), 4 negatif kontrol kuyu ve 1 pozitif kontrolü de içeren bir 96-şey PCR tabak. (C) genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma-yetkili, HIV-1 proviruses tanımlamak için kullanılan eleme süreci. Bu rakam Hiener ve ark. değiştirildi 2 . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
FLIPS tahlil yükseltecek ve tam uzunlukta HIV-1 proviruses yakınındaki sıralama tek için verimli ve yüksek işlem hacmi bir yöntemidir. Multipl faktörler ve protokol sayısı ve kalitesi elde sıralarının etkileyen kritik adımları tespit edilmiştir. İlk olarak, hücre sayısı ve hücre nüfus HIV-1 enfeksiyonu sıklığı güçlendirilmiş proviruses sayısını etkiler. Örneğin, bir önceki yayında yaklaşık yarısı kadar çok dizileri saf CD4 aynı numaradan+ T elde karşılaştırıldığında efektör bellek CD4 hücreleri+ T hücreleri. Saf hücreleri genellikle efektör bellek hücreleri2‘ den daha düşük bir enfeksiyon frekans sahip olmasıdır. İkinci olarak, hücre lizis sütunlara göre çıkarma yöntemleri olarak DNA ekstraksiyon sürecinde kaybetme riski yoktur genomik DNA elde etmek için tercih edilir. Son olarak, herhangi bir PCR tabanlı tahlil gibi ile bulaşma önlenmesi çok önemlidir. Ayrılmış temiz alanlarda ana karışımları, genomik DNA, pozitif denetimleri, DNA arıtma ve miktar ve Kütüphane hazırlık ekleme işleme hazırlamak için belirlenmiş olması. Bu tek kopya deneyleri burada sunulan biri gibi için özellikle önemlidir.
Uygulama döndürür testin ilk katılımcı örnekleri yerine pNL4-3 plazmid gibi olumlu bir denetimin çalıştırılması içermelidir. Kullanılabilir başvuru sıralarını bu Plasmid’ler için elde edilen dizileri karşılaştırıldığında bu herhangi bir sorun giderme önceden HIV-1 pozitif hücrelerinin, kullanımı için izin verir. HIV-1 pozitif hücrelerinin kullanırken, hiçbir proviruses için çok az güçlendirilmiş Eğer HIV-1 alt türü (astar döndürür alt B özgü için tasarlanmış) ve hücre nüfus enfeksiyonu sıklığı dikkate almak önemlidir. Astar dizileri modifiye/diğer alt türleri eşleştirmek için yeniden tasarlanmış olabilir. Ayrıca, bir de olumlu bir denetimi içeren gerçekleştirilen her PCR dahil edilmelidir.
FLIPS SPS dahil olmak üzere önceki sıralama deneyleri sınırlamaları aşmak. Yükseltecek ve sıralamanın tam uzunlukta HIV-1 proviruses yakınındaki döndürür olası çoğaltma yetkinlik, HIV-1 proviruses belirleyebilirsiniz. Bu sadece alt genomik bölgeleri sıralı ve bu nedenle diziler ile bozulmamış astar bağlayıcı siteleri için seçilen SPS kullanarak mümkün değildi. Ayrıca, FLIPS birden çok amplifikasyon ve sıralama astar, önceki tam uzunlukta sıralama deneyleri1,4tarafından istihdam edildi gibi kullanan ile ilgili sınırlamalar üstesinden gelir. NGS ile kombine HIV-1 lt. bölgeleri hedefleyen PCR iki tur üzerinden FLIPS sayısını ve astar gerekli karmaşıklığını azaltır. DÖNDÜRÜR bu nedenle astar uyuşmazlıkları, yani arızalı proviruses hatalı tanımlaması ve bazı proviruses bir nüfus içinde yükseltmek için bir yetersizlik sonuçlarını üzere. FLIPS Protokolü Ayrıca daha etkilidir ve bir yüksek-den geçerek sıralama daha önceki yöntemler sağlar.
Belli ki, FLIPS HIV-1 proviruses genetik kompozisyonu belirlemek mevcut yöntemler üzerinde avantajları sağlar. Ancak, FLIPS sınırlamaları kabul etmek önemlidir. Analizler FLIPS yükselterek olup olmadığını her HIV-1 provirus bir hücre nüfus mevcut belirlemek için tamamlanmamış gibi öncelikle, FLIPS tahlil gizli HIV-1 depo, boyutunu ölçmek için bir araç olarak geliştirilmiş değil. DÖNDÜRÜR, bunun yerine farklı hücre nüfus2arasında baraj gölünün kompozisyon göreli karşılaştırmaları yapmak için kullanışlıdır. İkinci olarak, çoğaltma-yetkinlik sağlam HIV-1 proviruses, in vivo analizleri, örneğin Ho vd tarafından geçekleştirilen olmadan kesinlikle tespit edilemez 4. üçüncü olarak, FLIPS HIV-1 proviruses entegrasyon siteyi belirlemek üzere tasarlanmamıştır.
Küçük varyasyonları FLIPS protokolü için uygulama artırabilir. Örneğin, dizileri farklı izin verebilirsiniz astar ve sıralı ve güçlendirilmiş için birden fazla HIV-1 alt türlerini değiştirir. Plazma HIV-1 virions nın cDNA sentez iç içe PCR önce eklenmesi mümkündür. Gelecekteki tek molekül sıralama yöntemleri kullanımı de novo derleme gereksinimini ortadan kaldırır.
Entegre HIV-1 proviruses genetik sıralama anlayışımız gizli HIV-1 baraj gölünün artmıştır. DÖNDÜRÜR kompozisyon ve dağıtım gizli rezervuar elucidating gelecekteki çalışmaları için önemli bir araçtır. Bununla birlikte, FLIPS uygulanması havzanın genişletebilirsiniz. Gelecekteki çalışmalar CRISPR-Cas teknoloji için belirli hedefler belirlemek veya kodlama belirlenmesine yardımcı için FLIPS yararlanmak ve virüs ajanları geri gecikme süresi için daha duyarlı olun kodlamayan bölgeler. Viral rekombinasyon büyük iç silme kavşak sitelerinde bakarak daha iyi anlamış.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser desteklenmiştir (1U19AI096109 ve 1UM1AI126611-01); bir çare bulmak için Delaney AIDS araştırma Enterprise (meydan) bir amfAR araştırma konsorsiyumu üzerinde HIV ortadan kaldırılması (ARCHE) ortak araştırma bursu Vakfı AIDS Araştırma (amfAR 108074-50-RGRL); Avustralya merkezi HIV ve hepatit Viroloji araştırma (ACH2); UCSF-GIVI merkezi AIDS Araştırma (P30 AI027763); Avustralya Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (AAP1061681). Dr. Joey Lai, genomik tesis yöneticisi kitaplığı hazırlık ve onun tesisi kullanımı onun eğitimi için tıbbi araştırma Westmead Enstitüsü’nde ve Ramaciotti merkezi genomik (University of New South Wales, Sidney, Avustralya) için teşekkür etmek istiyorum sıralama yürütmek için. Bu çalışma için örnekleri hibe katılımcılar Şükran ile anıyoruz.
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | Dilute to 5 mM for nested PCR |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma | 98379 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL) | Promega | AM2548 | |
96 well thermocycler | Any 96 well thermocycler can be used | ||
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
10X High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] | Invitrogen | 11304011 | |
50 mM MgSO4 | Invitrogen | 11304011 | |
PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | C1141 | |
Ultrapure H2O | Invitrogen | 10977023 | |
PCR1 and PCR2 Primers | Desalted. Dilute to (100 M) with H2O | ||
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | BioRad | MSB1001 | Required to seal 96 well PCR plates |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). | Diluted to 10^5 copies/mL and used as positive control | |
PCR plate spinner or benchtop centrifuge | |||
E-GEL 48 1% Agarose | Invitrogen | G800801 | Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide. |
DirectLoad Wide Range DNA Marker | Sigma | D7058 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
Mother E-Base device | Invitrogen | EBM03 | Required for running precast 48 well 1% agarose gels |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used |
PlateMax Peelable Heat Sealing | Axygen | HS-200 | Heat sealing film for long term storage |
96 Well 0.8 mL Storage Plate | ThermoFisher Scientific | AB0765 | 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification |
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) | Beckman Coulter | A63880 | Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106) |
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology | Sigma | E7023 | |
Magnetic Stand-96 | Invitrogen | AM10027 | |
Microplate shaker | Optional | ||
Buffer EB | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
Microplate reader | |||
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-2001 | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Biorad | HSP9601 | Required for Nextera XT DNA library preparation kit |
Library Quantification Kit – Illumina/Universal | Kapa Biosystems | KK4824 | Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029) |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technology | Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit | |
High Sensistivty DNA kit | Agilent Technology | 5067-4626 | |
Illumina MiSeq Platform | Illumina |