Studerar ribonucleotid införlivande: Strand-detektering av ribonukleotider i jäst genomet och mäta ribonucleotid-inducerad mutagenes
Summary
Ribonukleotider är bland de vanligast förekommande icke-kanoniska nukleotider införlivas genomet under eukaryota nuclear DNA-replikation. Om inte korrekt bort, kan ribonukleotider orsaka DNA-skador och mutagenes. Här presenterar vi två experimentella metoder som används för att bedöma överflödet av ribonucleotid införlivande i DNA och dess mutagena effekter.
Abstract
Förekomsten av ribonukleotider i nuclear DNA har visat sig vara en källa till genomisk instabilitet. Omfattningen av ribonucleotid införlivande kan bedömas genom alkalisk hydrolys och gel elektrofores som RNA är mycket mottagliga för hydrolys i alkaliska förhållanden. Detta, kan i kombination med Southern blot analys användas för att fastställa platsen och strand i som ribonukleotider har införlivats. Dock detta förfarande är endast semikvantitativt och kanske inte är tillräckligt känslig för att detektera små förändringar i ribonucleotid innehåll, även om strand-specifika Southern blot sondera förbättrar känsligheten. Som ett mått på en av de mest slående biologiska konsekvenserna av ribonukleotider i DNA, kan spontana mutagenes analyseras med hjälp en framåt mutationsanalys. Använda lämpliga reporter gener, sällsynta mutationer som resulterar i förlust av funktion kan vara markerade och övergripande och specifika mutation priser kan mätas genom att kombinera data från fluktuation experiment med DNA-sekvensering av reporter genen. Fluktuation analysen gäller att undersöka ett stort antal mutagena processer i specifika genetiska bakgrunden eller tillväxt villkorar.
Introduction
Under eukaryota nuclear DNA-replikation inlemmas ribonukleotider genomet genom alla tre stora DNA replicases, DNA-polymerases (Pols) α, ε och δ1,2. RNase H2-beroende ribonucleotid excision reparation (RER3) tar bort flesta av dessa inbäddade ribonukleotider.
En ribonucleotid i DNA är mottagliga för hydrolys, som hydroxylgruppen 2′ av den socker biexponentiellt kan attackera den intilliggande phosphodiester bond, släppa ena änden med en icke-cyklisk fosfat i 2′ – 3′-änden och den andra med en 5′-OH4. Alkaliska förhållanden kan avsevärt påskynda denna reaktion. Således, hydrolys av inbäddade ribonukleotider under inkubation i en grundläggande lösning orsakar fragmentering av genomisk DNA, som kan visualiseras av alkaliska-agaros elektrofores5. Detta DNA kan överföras till ett membran och trotsat av Southern blot analys med strand-specifika prober som tillåter identifiering av Alkalikänsliga webbplatser orsakas av ribonukleotider införlivas i den begynnande ledande – eller släpar-strand DNA, respektive.
I jästceller saknar RNase H2 aktivitet, kan borttagning av ribonukleotider initieras när topoisomeras I (Top1) nicks DNA på den inbäddade ribonucleotid6,7. Men när Top1 klyver på 3′ sida av ribonucleotiden, genererar detta 5′-OH och 2′ – 3′ cykliska fosfat DNA ändar som är refraktära mot religation. Reparation eller avvikande bearbetning av dessa ‘smutsiga slutar’ kan leda till genomisk instabilitet. Dessutom om snittet sker inom en upprepad DNA-sekvens, kan reparationsprocessen leda till radering mutationer. Detta är särskilt problematiskt för tandem upprepas, där kort borttagningar (av mellan två och fem baspar) är vanligt förekommande i RNase H2-brist celler. Top1-beroende skadliga effekterna i avsaknad av jäst RNase H2 aktiviteten förvärras i en ε muterad DNA-polymeras (pol2-M644G) promiskuös för ribonucleotid införlivande under begynnande ledande strand syntes.
Bearbetning av ribonukleotider i DNA leder till spontana mutationer och denna mutagenes kan upptäckas med hjälp av lämpliga reporter gener och att välja för den medföljande fenotypisk förändringen. En fluktuation test eller Luria och Delbrück experiment är en av de vanligaste metoderna att mäta spontan mutation priser med valbar reporter gener8,9. I jäst, kan URA3 och CAN1 generna användas som reportrar i en framåt mutationsanalys, vilket möjliggör detektering av alla typer av mutation som resulterar i förlust av geners funktion. Den spontana mutationshastighet uppskattas som medianen av som observerats för flera parallella kulturer startade från enstaka kolonier utan mutationer i reporter målgenen. En jäst RNase H2-brist stam som rnh201Δ har en måttligt förhöjda övergripande spontan mutation som orsakas huvudsakligen av en förhöjd incidens av 2-5 bp borttagningar i tandem upprepa sekvenser. Således, för att fullständigt karakterisera de mutagena effekterna av ribonukleotider i genomet, specifik mutation priser behöver fastställas. I detta fall kan URA3 eller CAN1 reporter generna vara förstärkt sekvenserade för att fastställa typer och platser av mutationerna och specifik mutation priser kan beräknas. Sammanställa mutationer identifieras i flera oberoende URA3 eller CAN1 mutanter kan sedan användas för att generera en mutation spektrum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi protokollen för två uppsättningar av experiment som ofta används till semi kvantitativt analysera ribonukleotider införlivas under DNA-replikation och mutagena effekter av oreparerade ribonukleotider. Även om dessa strategier innebär den modell Eukaryoter S. cerevisiae, kan dessa tekniker enkelt anpassas till andra mikrober och ännu högre Eukaryoter.
Sondera för oreparerade ribonukleotider i DNA använder alkaliska-agaros elektrofores tillsammans med södra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar alla nuvarande och tidigare medlemmar av Kunkel Lab för deras arbete och diskussioner relaterade till protokollet och återanvändas data som presenteras här. Detta arbete stöds av projektet Z01 ES065070 till T.A.K. av avdelningen för intern forskning av de National institutionerna of Health (NIH), nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS).
Materials
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
- Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
- Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2′-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
- Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
- Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. 유전학. 136 (3), 1209-1216 (1994).
- Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2001).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
- Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
- Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
- Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. 유전학. 159 (1), 47-64 (2001).
- Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
- Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
- Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
- Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
- Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).
