استخدام الماوس سبلينوسيتيس لتقييم تأثير نمط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة في التعبير الجيني على مدار الساعة
Summary
ويصف هذا البروتوكول تقنية باستخدام الماوس سبلينوسيتيس لاكتشاف أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة التي تغير التعبير الجيني الجزيئي على مدار الساعة.
Abstract
من السلوك للتعبير الجيني، تنظيم إيقاعات circadian تقريبا جميع جوانب علم وظائف الأعضاء. وهنا، نقدم منهجية لتحدي سبلينوسيتيس الماوس مع أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (بامبس) lipopolysaccharide (LPS)، ODN1826، وقتل الحرارة الليستريه المستوحدة ، ودراسة أثرها على الجزيئية الإيقاعية على مدار الساعة. سابقا، وقد ركزت الدراسات على دراسة تأثير لبس على مدار الساعة الجزيئية باستخدام مجموعة متنوعة من النهج في فيفو و السابقين فيفو من مجموعة متنوعة نماذج (مثل الماوس وفار، والإنسان). ويصف هذا البروتوكول بالعزلة والتحدي سبلينوسيتيس، فضلا عن المنهجية لتقييم ساعة الجينات التعبير التحدي فيما بعد عن طريق PCR الكمي. يمكن استخدام هذا النهج لتقييم ليس فقط تأثير العناصر الجرثومية على مدار الساعة الجزيئية لكن الجزيئات الأخرى، فضلا عن أنه قد يغير التعبير على مدار الساعة. ويمكن استخدام هذا النهج في ندف أربا الآلية الجزيئية لكيفية تأثير تفاعل مستقبلات بمب-عدد القتلى-مثل التعبير على مدار الساعة.
Introduction
الساعة الرئيسية في الثدييات، الذي ينظم ذبذبات ح 24 لما يقرب من جميع الجوانب لعلم وظائف الأعضاء والسلوك، يقع داخل نواة suprachiasmatic (SCN)1،تحت المهاد2. وبالإضافة إلى تنظيم العمليات البيولوجية على المستوى العضوي، مزامنة الساعة الرئيسية أيضا الطرفية الساعات الخلوية في جميع أنحاء الجسم3،،من45. بينما تتألف الآلية الجزيئية على مدار الساعة من على الأقل ثلاث حلقات التغذية المرتدة النسخي متعدية المتشابكة، نواة تتكون من الفترة (Per1-3)، كريبتوتشرومي (Cry1-2)، Bmal1، و على مدار الساعة الجينات6،7. إلى جانب الحفاظ على دقة توقيت ساعة جزيئية أساسية، بعض منتجات الجينات المساعدة على مدار الساعة (مثلاً، القس-erbα و دبة) أيضا تنظيم الجينات غير على مدار الساعة، أي ساعة الجينات التي تسيطر عليها (ككجس)6 , 7.
وقد وصف الساعات الجزيئية الوظيفية في مختلف الأنسجة المناعية (مثلاً، الطحال والعقد الليمفاوية)8 والخلايا (مثلاً ب الخلايا، والخلايا الجذعية، الضامة)8،9. الكشف عن هذه الخلايا وتستجيب لمسببات الأمراض المرتبطة أنماط الجزيئية (بامبس)، المكونات الميكروبية مصانة، عن طريق مستقبلات الاعتراف المناعة الفطرية مثل عدد القتلى تشبه المستقبلات (TLRs)10. حتى الآن، وقد وصف 13 TLRs الوظيفية، التي تعترف بمكونات الميكروبية مثل مكونات جدار الخلية البكتيرية وفلاجلر البروتين والأحماض النووية الجرثومية10. لقد ثبت بمب، lipopolysaccharide (LPS)، مكون جدار الخلية للبكتيريا سلبية الغرام المعترف بها TLR4، إلى تغيير إيقاعات circadian على المستويين العضوي والجزيئية على حد سواء. على سبيل المثال، الناجم عن تأخر المرحلة مضاءة مثل مقاسا بنشاط في الفئران11 في فيفو التحدي للبس وأدت إلى انخفاض على مدار الساعة التعبير الجيني في اللجنة الفرعية للتغذية في الكبد كما تحددها التهجين في الموقع و PCR الكمي، على التوالي، في12من الفئران. بعد تحديا في فيفو مع لبس، كشف تحليل للدم المحيطي البشري الكريات البيضاء13 و14 من الأنسجة الدهنية تحت الجلد التعبير غيرت عدة الجينات على مدار الساعة الذي يقاس عن طريق قبكر. أخيرا، غيرت السابقين فيفو التحديات لبس الضامة البشرية والضامة البريتوني الماوس، أدت أيضا إلى التعبير على مدار الساعة مقاسا قبكر14.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتقييم تأثير “لبس بامبس”، ODN1826 (أونميثيلاتيد النوكليوتيد الاصطناعية التي تحتوي على زخارف البد)، وقتلت الحرارة الليستريه المستوحدة (HKLM)، المعترف بها TLR4 و TLR9 و TLR2، على التوالي، التعبير الجيني الجزيئي على مدار الساعة في سبلينوسيتيس الماوس. ويتضمن البروتوكول استئصال الماوس والعزلة سبلينوسيتي والتحدي والحمض النووي الريبي استخراج، كدنا التوليف و qPCR لتقييم العديد من الجينات على مدار الساعة. يسمح هذا البروتوكول للحصول في الوقت المناسب على عدد كبير من الخلايا المناعية مع القليل جداً من الحيوان أو التلاعب الخلوية، التي يمكن ثم طعن السابقين فيفو مع بامبس مختلف. لقد ثبت على مدار الساعة الجزيئية لتعدل مختلف جوانب الاستجابة المناعية8،،من1516، ولذلك توقف عقارب الساعة الجزيئية يضر على الأرجح الاختلاف تعتمد على الوقت المناسب الاستجابة المناعية. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لانقطاع إيقاعات circadian يمكن أن تؤدي إلى أمراض خطيرة17،18،،من1920، قد تكون ذات فائدة للباحثين لتحدي سبلينوسيتيس مع مجموعة واسعة من الجزيئات وتقييم تأثيرها على مدار الساعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ضمن هذا البروتوكول، يمكن استخدامها جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي قياس وتقييم نقاء الجيش الملكي النيبالي المستخدمة في تحديد التعبير الجيني. امتصاص الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في 260 من الأحماض النووية شمال البحر الأبيض المتوسط، البروتينات عادة تمتص الضوء في 280 نانومتر، بينما الملوثات …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها المنح “البحثية كلية” من مكتب بكلية الآداب والعلوم عميد في جامعة هارتفورد.
Materials
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | |
| 15 ml tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O’Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- . Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
