Het gebruik van de muis Splenocytes om te beoordelen van de pathogeen-geassocieerde moleculaire patroon invloed op klok genexpressie
Summary
Dit protocol beschrijft een techniek met behulp van de muis splenocytes te ontdekken van de pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen die veranderen van moleculaire klok genexpressie.
Abstract
Van gedrag naar genexpressie reguleren circadiane ritmen bijna alle aspecten van de fysiologie. Hier presenteren we een methodologie om te vechten muis splenocytes met de pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), ODN1826 en warmte-gedood Listeria monocytogenes en onderzoeken van hun effect op de moleculaire circadiane klok. Eerder, hebben studies gericht op het onderzoeken van de invloed van LPS op de moleculaire klok met behulp van een verscheidenheid van in vivo en ex vivo benaderingen uit een assortiment van modellen (bijvoorbeeld, muis, rat en mens). Dit protocol beschrijft de isolatie en de uitdaging van splenocytes, evenals de methodologie voor de beoordeling van de klok gen expressie na uitdaging via kwantitatieve PCR. Deze benadering kan worden gebruikt om te evalueren van niet alleen de invloed van microbiële onderdelen op de moleculaire klok maar ook andere moleculen die expressie van de klok kan veranderen. Deze aanpak kan worden gebruikt om de plagen uit elkaar het moleculaire mechanisme van hoe PAMP-Toll-like receptor interactie klok expressie beïnvloedt.
Introduction
De master klok in zoogdieren, die 24u oscillaties voor bijna alle aspecten van de Fysiologie en gedrag regisseert, is gelegen in de kern (SCN) van de suprachiasmatic van de hypothalamus1,2. Naast het reguleren van biologische processen op een organisch niveau, synchroniseert de master klok ook perifere cellulaire klokken in heel het lichaam3,4,5. Terwijl de moleculaire klok machine uit ten minste drie elkaar grijpende transcriptionele-translationeel feedbacklussen bestaat, de kern bestaat uit de periode (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, en klok genen6,7. Naast het behoud van de precieze timing van de kern moleculaire klok, sommige bijkomende klok genproducten (bijvoorbeeld Rev-erbα en Dbp) regelen ook expressie van genen die niet-klok, dat wil zeggen, klok gecontroleerde genen (CCGs)6 , 7.
Functionele moleculaire klokken zijn beschreven in de diverse immuun weefsels (bijvoorbeeld, milt en lymfklieren)8 en cellen (bijvoorbeeld B cellen, dendritische cellen, macrofagen)8,9. Deze cellen detecteren en inspelen op de pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), geconserveerde microbiële componenten, via receptoren van het aangeboren immuun erkenning zoals Toll-like receptoren (TLRs)10. Tot op heden, zijn 13 functionele TLRs beschreven, die microbiële bestanddelen zoals bacteriële celwand onderdelen, flagellar eiwitten en nucleïnezuren microbiële10herkennen. De PAMP, lipopolysaccharide (LPS), een onderdeel van de celwand van gram-negatieve bacteriën herkend door TLR4, heeft aangetoond dat het circadiane ritmen op zowel organisch en moleculaire niveau wijzigen. Bijvoorbeeld, in vivo uitdaging van LPS geïnduceerde fotische-achtige fase vertragingen zoals gemeten door activiteit in muizen11 en heeft geleid tot verminderde klok genexpressie in de SCN en de lever in situ hybridisatie en kwantitatieve PCR, volgens respectievelijk in ratten12. Na een in vivo uitdaging met LP’s bleek de analyse van perifere bloed leukocyten13 en onderhuids vetweefsel14 veranderde expressie van verschillende klok genen zoals gemeten via qPCR. Tot slot, ex vivo LPS uitdagingen van menselijke macrofagen en muis peritoneale macrofagen, ook geleid tot gewijzigd klok expressie zoals gemeten door qPCR14.
Hier beschrijven we een protocol voor de beoordeling van de invloed van de PAMPs LP’s, ODN1826 (synthetische oligonucleotides met unmethylated apr motieven), en warmte-gedood Listeria monocytogenes (HKLM), erkend door TLR4, TLR9 en TLR2, respectievelijk op moleculaire klok genexpressie in muis splenocytes. Het protocol bevat muis splenectomie, splenocyte isolatie en uitdaging, RNA extractie, cDNA synthese en qPCR om te beoordelen van de expressie van genen die verschillende klok. Dit protocol zorgt voor de tijdige verwerving van een groot aantal immuuncellen met zeer weinig dier of cellulaire manipulatie, die vervolgens kan worden uitgedaagd ex vivo met verschillende PAMPs. De moleculaire klok is aangetoond dat het moduleren van de verschillende aspecten van de immuunrespons8,15,16, verstoring van de moleculaire klok zou daarom waarschijnlijk afbreuk doen aan de correcte tijd-afhankelijke variant van de immuunrespons. Bovendien, aangezien onderbrekingen van de circadiane ritmen tot ernstige pathologieën17,18,19,20 leiden kunnen, kan het interessant zijn voor onderzoekers aan te vechten van splenocytes met een breed scala aan moleculen en hun invloed op de klok te beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Binnen dit protocol, kan een spectrofotometer microvolume worden gebruikt om te kwantificeren en beoordelen van de zuiverheid van het RNA wordt gebruikt bij het bepalen van de genexpressie. Nucleïnezuren absorberen UV-licht op 260 nm, eiwitten absorberen meestal licht op 280 nm, terwijl andere potentiële verontreinigingen gebruikt tijdens een RNA extractie procedure (bijv . fenol) aantoonbaar op 230 nm. Dus, door beoordeling van de extinctie (A) verhouding op 260/280 nm (RNA naar eiwitten) en 260/230 nm (RNA v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door onderzoek van de faculteit van de College of Arts and Sciences Dean’s kantoor aan de Universiteit van Hartford verleent.
Materials
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | |
| 15 ml tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O’Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- . Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
