L’utilisation des splénocytes de souris afin d’évaluer les micro-organismes pathogènes associés un motif moléculaire Influence sur l’Expression génique horloge
Summary
Ce protocole décrit une technique utilisant des splénocytes de souris pour découvrir les modèles moléculaires associés aux pathogènes qui modifient l’expression des gènes horloge moléculaire.
Abstract
De comportement à l’expression des gènes, les rythmes circadiens réglementer presque tous les aspects de la physiologie. Nous présentons ici une méthodologie pour contester les splénocytes de souris avec les profils moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), ODN1826 et tués par la chaleur de Listeria monocytogenes et examiner leur effet sur le moléculaire circadienne horloge. Auparavant, les études ont porté sur l’examen de l’influence des LPS sur l’horloge moléculaire en utilisant une variété d’approches in vivo et ex vivo parmi un assortiment de modèles (p. ex., souris, rat et homme). Ce protocole décrit l’isolement et le défi de splénocytes, ainsi que la méthodologie pour évaluer l’horloge gene expression défi post par PCR quantitative. Cette approche peut être utilisée pour évaluer non seulement l’influence des composantes microbiennes sur l’horloge moléculaire mais aussi bien des autres molécules qui peut-être modifier l’expression de l’horloge. Cette approche pourrait être utilisée pour distinguer le mécanisme moléculaire de l’interaction de PAMP-Toll-like receptor influence qu’expression de l’horloge.
Introduction
L’horloge maître chez les mammifères, qui orchestre les oscillations de 24h pour presque tous les aspects de la physiologie et le comportement, est situé dans le noyau suprachiasmatic (SCN) de l’hypothalamus1,2. En plus de réglementer les processus biologiques au niveau organismique, l’horloge maître synchronise également les périphériques horloges cellulaires dans tout le corps3,4,5. Alors que le mécanisme de l’horloge moléculaire est constitué d’au moins trois boucles de rétroaction transcriptionnel traductionnel imbriquées, le noyau est composé de la période (PAR1-3), les cryptochromes (Cry1-2), les Bmal1, et horloge gènes6,7. Outre le maintien du moment précis de l’horloge moléculaire de base, certains produits de gène horloge auxiliaires (p. ex., Rev-erbα et Dbp) aussi régulent l’expression de gènes non-horloge, horloge soit contrôlé gènes (NGCC)6 , 7.
Les horloges moléculaires fonctionnels ont été décrites dans les différents tissus immunitaires (p. ex., la rate et des ganglions lymphatiques)8 et cellules (par exemple, B cellules, cellules dendritiques, macrophages)8,9. Ces cellules détecter et réagir aux micro-organismes pathogènes associés profils moléculaires (PAMPs), composants microbiens conservées, via des récepteurs de reconnaissance immunitaire innée comme les récepteurs Toll-like (TLRs)10. A ce jour, 13 TLR fonctionnelles ont été décrits, qui reconnaissent les constituants microbiens tels que les composants de la paroi cellulaire bactérienne, flagellaire protéines et acides nucléiques microbienne10. Le PAMP, lipopolysaccharide (LPS), un composant de la paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif reconnu par TLR4, s’est avéré altérer les rythmes circadiens aux niveaux moléculaires et organismiques. Par exemple, en vivo défi de LPS induit par les retards de phase de type photique telle que mesurée par l’activité souris11 et conduit à horloge réduit l’expression des gènes dans le SCN et le foie, tel que déterminé par hybridation in situ et PCR quantitative, respectivement, chez les rats12. Après un défi en vivo avec LPS, analyse de sang périphérique humain leucocytes13 et du tissu adipeux sous-cutané14 ont révélé une expression altérée de plusieurs gènes de l’horloge tel que mesuré par l’intermédiaire de qPCR. Enfin, ex vivo défis LPS des macrophages humains et macrophages péritonéaux de souris, a également conduits à altération de l’expression de l’horloge tel que mesuré par qPCR14.
Nous décrivons ici un protocole pour évaluer l’influence du LPS PAMPs, ODN1826 (oligonucléotides synthétiques contenant unmethylated motifs CpG) et tués par la chaleur Listeria monocytogenes (HKLM), reconnu par le TLR4 et TLR9 TLR2, respectivement, sur expression du gène horloge moléculaire en splénocytes de souris. Le protocole inclut une splénectomie souris, isolement de splénocytes et défi, RNA extraction, synthèse de cDNA et qPCR afin d’évaluer l’expression de plusieurs gènes de l’horloge. Ce protocole permet l’acquisition rapide d’un grand nombre de cellules immunitaires avec très peu d’animaux ou manipulation cellulaire, qui peut ensuite être contestée ex vivo avec PAMPs différents. L’horloge moléculaire a été montré pour moduler les divers aspects de la réponse immunitaire8,15,16, donc, dérèglement de l’horloge moléculaire nuirait très probablement la bonne variation dépendant du temps de la réponse immunitaire. En outre, étant donné que les perturbations des rythmes circadiens peuvent conduire à des pathologies graves17,18,19,20, il peut être d’intérêt pour les chercheurs de contester les splénocytes avec un large éventail de molécules et d’évaluer leur influence sur l’horloge.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, un spectrophotomètre microvolume permet de quantifier et d’évaluer la pureté de l’ARN étant utilisé dans la détermination de l’expression des gènes. Acides nucléiques absorber les ultraviolets à 260 nm, en général, les protéines absorbent la lumière à 280 nm, tandis que d’autres contaminants potentiels utilisés pendant le processus d’extraction RNA (p. ex., phénol) sont détectables à 230 nm. Par conséquent, en évaluant l’absorbance (A) ratio 260/280 nm (ARN de p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche de la faculté du Bureau du Collège des Arts et Sciences Dean à l’Université de Hartford.
Materials
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | |
| 15 ml tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
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