माउस Splenocytes का उपयोग रोगज़नक़ का आकलन करने के लिए-घड़ी जीन अभिव्यक्ति पर आणविक पैटर्न प्रभाव जुड़े
Summary
इस प्रोटोकॉल एक माउस splenocytes का उपयोग करने के लिए रोगज़नक़ की खोज तकनीक का वर्णन आणविक पैटर्न है कि आणविक घड़ी जीन अभिव्यक्ति बदल जुड़े ।
Abstract
जीन अभिव्यक्ति के व्यवहार से, circadian लय शरीर विज्ञान के लगभग सभी पहलुओं को विनियमित. यहां, हम एक पद्धति मौजूद रोगज़नक़ के साथ माउस splenocytes चुनौती-जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) lipopolysaccharide (एलपीएस), ODN1826, और गर्मी लिस्टिरिया monocytogenes मारे गए और आणविक circadian पर उनके प्रभाव की जांच घड़ी. पहले, अध्ययनों से एक किस्म का उपयोग कर आणविक घड़ी पर एलपीएस के प्रभाव की जांच पर ध्यान केंद्रित किया है vivo और पूर्व vivo दृष्टिकोण में मॉडलों के एक वर्गीकरण से (जैसे, माउस, चूहा, और मानव) । इस प्रोटोकॉल अलगाव और splenocytes की चुनौती का वर्णन है, साथ ही पद्धति को मात्रात्मक पीसीआर के माध्यम से घड़ी जीन अभिव्यक्ति पोस्ट चुनौती का आकलन करने के लिए । इस दृष्टिकोण को न केवल आणविक घड़ी पर अंय अणुओं के रूप में अच्छी तरह से है कि घड़ी की अभिव्यक्ति बदल सकता है पर माइक्रोबियल घटकों के प्रभाव का आकलन किया जा सकता है । इस दृष्टिकोण के अलावा कैसे PAMP-टोल रिसेप्टर इंटरेक्शन की तरह घड़ी अभिव्यक्ति प्रभाव के आणविक तंत्र को चिढ़ाने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
Introduction
स्तनधारियों में मास्टर घड़ी, जो शरीर विज्ञान और व्यवहार के लगभग सभी पहलुओं के लिए 24 एच दोलनों आर्केस्ट्रा, hypothalamus1,2के suprachiasmatic नाभिक (SCN) के भीतर स्थित है । एक जीव स्तर पर जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित करने के अलावा, मास्टर घड़ी भी शरीर3,4,5भर में परिधीय सेलुलर घड़ियों सिंक्रनाइज़ । जबकि आणविक घड़ी मशीनरी के होते हैं कम से तीन इंटरलाकिंग transcriptional-शोधों प्रतिक्रिया छोरों, कोर शामिल है की अवधि (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, और घड़ी जीन6,7। कोर आणविक घड़ी के सटीक समय को बनाए रखने के अलावा, कुछ सहायक घड़ी जीन उत्पादों (जैसे, Rev-erbα और Dbp) भी गैर घड़ी जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित, यानी, घड़ी नियंत्रित जीन (CCGs)6 , 7.
कार्यात्मक आणविक घड़ियों विभिन्न प्रतिरक्षा ऊतकों में वर्णित किया गया है (जैसे, तिल्ली और लिम्फ नोड्स)8 और कोशिकाओं (जैसे, बी कोशिकाओं, वृक्ष कोशिकाओं, मैक्रोफेज)8,9. इन कोशिकाओं का पता लगाने और रोगज़नक़-जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) का जवाब, सूक्ष्म प्रतिरक्षा मान्यता रिसेप्टर्स जैसे टोल जैसे रिसेप्टर्स (TLRs)10के माध्यम से, माइक्रोबियल घटकों के संरक्षण. तारीख करने के लिए, 13 कार्यात्मक TLRs वर्णित किया गया है, जो बैक्टीरियल कोशिका दीवार घटकों, flagellar प्रोटीन, और माइक्रोबियल न्यूक्लिक एसिड10के रूप में माइक्रोबियल घटक पहचान । PAMP, lipopolysaccharide (एलपीएस), TLR4 द्वारा मांयता प्राप्त ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया की एक कोशिका दीवार घटक, दोनों जीव और आणविक स्तर पर circadian लय में परिवर्तन करने के लिए दिखाया गया है । उदाहरण के लिए, vivo चैलेंज में एलपीएस प्रेरित photic-जैसे चरण विलंब चूहों11 में गतिविधि द्वारा मापा और SCN और जिगर में कम घड़ी जीन अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व के रूप में सीटू संकरण और मात्रात्मक पीसीआर में द्वारा निर्धारित, क्रमशः, चूहों में12. एलपीएस के साथ vivo चैलेंज में एक के बाद, मानव परिधीय रक्त ल्यूकोसाइट्स13 के विश्लेषण और चमड़े के नीचे वसा ऊतक14 qPCR के माध्यम से मापा के रूप में कई घड़ी जीन की बदली अभिव्यक्ति का पता चला. अंत में, पूर्व मानव मैक्रोफेज और माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज की vivo एलपीएस चुनौतियां भी बदल घड़ी अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व के रूप में14qPCR द्वारा मापा ।
यहां, हम PAMPs एलपीएस, ODN1826 (सिंथेटिक oligonucleotides युक्त unmethylated CpG रूपांकनों), और गर्मी मारे लिस्टिरिया monocytogenes (HKLM), TLR4, TLR9, और TLR2, क्रमशः द्वारा मांयता प्राप्त के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन आणविक घड़ी माउस splenocytes में जीन अभिव्यक्ति । प्रोटोकॉल माउस splenectomy, splenocyte अलगाव और चुनौती, आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण, और qPCR कई घड़ी जीन की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए शामिल है । इस प्रोटोकॉल बहुत कम जानवर या सेलुलर हेरफेर है, जो तब विभिंन PAMPs के साथ पूर्व vivo चुनौती दी जा सकती है के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के समय पर अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है । आणविक घड़ी के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया8,15,16, के विभिंन पहलुओं को मिलाना दिखाया गया है इसलिए, आणविक घड़ी के विघटन की संभावना सबसे उचित समय निर्भर भिंनता ख़राब होगा प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया । इसके अलावा, के बाद से circadian लय के विघटन गंभीर विकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं17,18,19,20, यह एक विस्तृत श्रृंखला के साथ splenocytes चुनौती के लिए शोधकर्ताओं के लिए ब्याज की हो सकती है अणु और घड़ी पर उनके प्रभाव का आकलन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के भीतर, एक microvolume spectrophotometer के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और आरएनए की शुद्धता का आकलन जीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करने में इस्तेमाल किया जा रहा है । न्यूक्लिक एसिड २६० एनएम पर यूवी प्रकाश को अव?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम Hartford विश्वविद्यालय में कला और विज्ञान के डीन कार्यालय के कॉलेज से संकाय अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | |
| 15 ml tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
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