병원 체 관련 된 분자 패턴 시계 유전자 발현에 영향을 평가 하기 위해 마우스 Splenocytes 사용 하 여
Summary
이 프로토콜 마우스 splenocytes를 사용 하 여 분자 시계 유전자 발현을 변경 하는 병원 체 관련 된 분자 패턴을 검색 하는 기술을 설명 합니다.
Abstract
유전자 발현을 행동, circadian 리듬 생리학의 거의 모든 측면을 통제 한다. 여기, 우리 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), ODN1826, 및 열 죽 Listeria monocytogenes 와 마우스 splenocytes 도전 circadian는 분자에 그들의 효과 검사 하는 방법론을 제시 시계입니다. 이전, 연구는 다양 한 모델 (예: 마우스, 쥐, 및 인간)의 구색에서 vivo에서 및 비보 전 접근을 사용 하 여 분자 시계에 LPS의 영향 검토에 집중 했다. 이 프로토콜에는 분리와 시계 유전자 식 후 도전 정량 PCR 통해 평가 하는 방법론으로 splenocytes, 도전 설명 합니다. 이 방법은 시계의 식 변경할 수 있는 다른 분자 뿐만 아니라 분자 시계에 미생물 구성 요소 뿐만 아니라 영향을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 이렇게 애타게 떨어져 어떻게 PAMP 통행세 같이 수용 체 상호 작용에 영향을 미치는 시계 식의 분자 메커니즘을 활용 될 수 있습니다.
Introduction
생리학 및 행동의 거의 모든 측면에 대 한 24 시간 진동 총괄, 포유류, 마스터 클록은 시상 하 부1,2의 suprachiasmatic 핵 (SCN) 내에 있습니다. Organismal 수준에 생물학 과정을 통제, 이외 마스터 클록도 시체3,,45를 통해 주변 세포 시계를 동기화 합니다. 핵심 이루어져 있다 기간 (Per1-3), 신장의 (Cry1-2), Bmal1을 최소한 3 개의 맞물리는 transcriptional 변환 피드백 루프 분자 시계 기계 장치에 의하여 이루어져 있다, 하는 동안 그리고 시계 유전자6,7. 핵심 분자 시계의 정확한 타이밍을 유지, 게다가 일부 보조 시계 유전자 제품 (예, 레 브 erbα 및 Dbp) 또한 비 시계 유전자의 표현을 규제, 즉, 시계 제어 유전자 (CCGs)6 , 7.
기능성 분자 시계 다양 한 면역 조직 (예를 들어, 비장 및 림프절)8 셀 (예를 들어, B 세포, 수지상 세포, 대 식 세포)8,9에서 설명 했습니다. 이 세포를 감지 하 고 응답 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs), 수용 체 통행세 같이 (TLRs)10등 타고 난 면역 인식 수용 체를 통해 보존된 미생물 구성 요소. 날짜 하려면, 13 기능 TLRs는 설명, 세균성 세포 벽 구성 요소, flagellar 단백질, 핵 산 미생물10등 미생물 성분 인식 하는. PAMP, lipopolysaccharide (LPS), TLR4에 의해 인식 하는 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소 organismal와 분자 수준에서 circadian 리듬 변경 표시 되었습니다. 예를 들어 vivo에서 LPS의 빛 같은 위상 지연 마우스11 활동에 의해 측정 된 유도 도전과 SCN에 간 현장에서 교 잡 그리고 양이 많은 PCR에 의해 결정으로 감소 된 시계 유전자 발현에 쥐12에서 각각. vivo에서 도전 LPS와, 후 인간의 말 초 혈액 백혈구13 및 피하 지방 조직14 의 분석 통해 정량 측정으로 여러 시계 유전자의 바꾸 인된 표현을 밝혔다. 마지막으로, 인간의 세포와도 마우스 복 막 대 식 세포의 LPS 도전 비보 전 시계 식 정량14측정으로 변경.
여기, 우리 PAMPs LPS, ODN1826 (를 포함 하는 합성 oligonucleotides CpG 모티브 unmethylated)의 영향을 평가 하기 위해 프로토콜 설명 및 열 죽 Listeria monocytogenes (HKLM)에 의해 인식 TLR4, TLR9, 그리고 TLR2, 각각,에 분자 시계 유전자 식 마우스 splenocytes에. 프로토콜에는 마우스 splenectomy splenocyte 격리 및 도전, RNA 추출, cDNA 합성, 정량 여러 시계 유전자의 표정을 평가 하 포함 되어 있습니다. 이 프로토콜 면역 세포와 아주 작은 동물의 많은 수의 적시 취득 또는 세포 조작, 다음 수 있는 비보 전 다양 한 PAMPs와 도전. 분자 시계 변조 면역 응답8,,1516의 다양 한 측면을 보여줘 왔다, 그러므로, 분자 시계의 대부분의 적절 한 시간에 따른 변형 자유로울 것는 면역 응답입니다. 또한, 이후 circadian 리듬의 붕괴는 심각한 병 리17,18,,1920으로 이어질 수 있습니다., 그것은 연구자 도전 splenocytes의 넓은 범위에 대 한 관심의 있을 수 있습니다. 분자 시계에 그들의 영향을 평가 하 고.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜 내에서 계량 하 여 유전자 발현을 결정 하는데 사용 되는 RNA의 순도 평가 microvolume 분 광 광도 계를 사용할 수 있습니다. 260에 자외선을 흡수 하는 핵 산 nm, 일반적으로 280에 빛을 흡수 하는 단백질 nm, 다른 잠재적인 오염 물질 RNA 추출 절차 (예, 페 놀) 동안 사용 되는 230에서 감지 하는 동안 nm. 따라서, () 비율 260/280에서 흡 광도 평가 하 여 nm (단백질 RNA) 및 260/230 nm (비 단백질 오?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에 의해 지원 되었다 하트포드의 대학에서 대학 예술과 과학의 학장의 사무실에서 교수 연구 보조금.
Materials
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | |
| 15 ml tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O’Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- . Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
