Bruk av mus Splenocytes å vurdere patogen-forbundet molekylær mønster innflytelse på klokken genuttrykk
Summary
Denne protokollen beskriver en teknikk som bruker musen splenocytes for å oppdage patogen-forbundet molekylær mønster som endrer molekylær klokke genuttrykk.
Abstract
Fra virkemåter genuttrykk regulere biologiske rytmer nesten alle aspekter av fysiologi. Her presenterer vi en metodikk for å utfordre musen splenocytes med patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPs) lipopolysakkarid (LPS), ODN1826 og varme-drepte Listeria monocytogenes og undersøke deres effekt på den molekylære circadian klokke. Tidligere har studier fokusert på å undersøke påvirkning av LPS på molekylær klokke med en rekke i vivo og ex vivo tilnærminger fra et utvalg av modeller (f.eks mus, rotte og menneskelige). Denne protokollen beskriver isolasjon og utfordringen med splenocytes, samt metodikken å vurdere klokke genet uttrykk etter utfordring via kvantitative PCR. Denne fremgangsmåten kan brukes til å vurdere ikke bare påvirker mikrobiell komponenter i molekylær klokke men andre molekyler som kan endre uttrykk for klokken. Denne tilnærmingen kan utnyttes for å erte hverandre molekylær mekanisme hvor PAMP-Toll-like reseptor interaksjon påvirker klokke uttrykk.
Introduction
Master klokken i pattedyr, som orkestrerer 24 h svingninger for nesten alle aspekter av fysiologi og atferd, ligger suprachiasmatic kjernen (SCN) i hypothalamus1,2. I tillegg til å regulere biologiske prosesser på organismebiologi nivå, synkroniserer master klokken også eksterne mobilnettet klokker hele kroppen3,4,5. Mens molekylær klokke maskiner består av minst tre sammenflettede transcriptional-translasjonsforskning tilbakemeldingssløyfer, består kjernen av perioden (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, og klokke gener6,7. I tillegg til å opprettholde nøyaktige tidspunktet for kjernen molekylær klokke, noen hjelpeutstyr klokke genet produkter (f.eks Rev-erbα og Dbp) også regulere uttrykk for ikke-klokke genene, dvs. klokke kontrollert gener (CCGs)6 , 7.
Funksjonell molekylær klokker er beskrevet i ulike immun vev (f.eks milten og lymfeknutene)8 og celler (f.eks B celler, dendrittiske celler, makrofager)8,9. Disse cellene gjenkjenner og svare på patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPs), konservert mikrobiell komponenter, via medfødte immunsystemet anerkjennelse reseptorer som Toll-like reseptorer (TLRs)10. Hittil har er 13 funksjonelle TLRs beskrevet, som gjenkjenner mikrobiell bestanddeler som bakteriell cellevegg komponenter, flagellar protein og mikrobiell nukleinsyrer10. PAMP, lipopolysakkarid (LPS), en cellevegg komponent av gram-negative bakterier anerkjent av TLR4, har vist seg å endre døgnrytme på både organismebiologi og molekylære. For eksempel i vivo utfordringen med LPS indusert photic-lignende fase forsinkelser målt ved aktivitet i mus11 og førte til redusert klokke genuttrykk i SCN og lever som i situ hybridisering og kvantitative PCR, i rotter12. Etter en i vivo utfordring med LPS avdekket analyse av menneskelig perifert blod leukocytter13 og underhud fettvev14 endret uttrykk for flere klokke gener målt via qPCR. Til slutt, ex vivo LPS utfordringer av menneskelig makrofager og mus peritoneal makrofager, førte også til forandret klokken uttrykk målt ved qPCR14.
Her beskriver vi en protokoll for å vurdere påvirkning av PAMPs LPS, ODN1826 (syntetisk oligonucleotides som inneholder unmethylated CpG motiver), og varme-drepte Listeria monocytogenes (HKLM), anerkjent av TLR4, TLR9 og TLR2, henholdsvis på molekylær klokke byggkorn under musen splenocytes. Protokollen inneholder musen splenectomy splenocyte isolasjon og utfordring, RNA utvinning, cDNA syntese og qPCR å vurdere uttrykk for flere klokke gener. Denne protokollen gir betimelig oppkjøpet av et stort antall immunceller med lite dyr eller cellular manipulasjon, som deretter kan utfordret ex vivo med ulike PAMPs. Molekylær klokken har blitt vist å modulere ulike aspekter av immunrespons8,15,16, derfor forstyrrelse av molekylære klokken ville mest sannsynlig svekke riktig tidsavhengige varianten av den immunrespons. I tillegg siden forstyrrelser av døgnrytme kan føre til alvorlige patologi17,18,19,20, kan det være av interesse for forskere å utfordre splenocytes med en rekke molekyler og vurdere deres innflytelse på klokken.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen, kan et microvolume spektrofotometer brukes å kvantifisere og vurdere renheten av RNA brukes ved genuttrykk. Nukleinsyrer absorbere UV-lys på 260 nm, proteiner vanligvis absorberer lys på 280 nm, mens andre mulige forurensninger under en RNA utvinning prosedyre (f.eks fenol) er synlig på 230 nm. Derfor ved å vurdere absorbansen (A) forholdet på 260/280 nm (RNA protein) og 260/230 nm (RNA til ikke-protein forurensninger) kvaliteten på RNA kan vurderes. Høy kvalitet RNA har en A260/280 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av fakultet forskning tilskudd fra College av kunst og vitenskap Dekanus kontor på University i Hartford.
Materials
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | |
| 15 ml tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O’Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- . Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
