Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse
Summary
Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l’etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell’organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.
Abstract
La neocorteccia dei mammiferi è composta di molti tipi di neuroni eccitatori ed inibitori, ognuno con specifiche proprietà elettrofisiologiche e biochimiche, connessioni sinaptiche, e in vivo funzioni, ma loro basic funzionale e anatomica organizzazione dal cellulare alla scala di rete è capita male. Qui descriviamo un metodo per l’imaging tridimensionale dei neuroni fluorescente etichettati attraverso grandi aree del cervello per l’indagine l’organizzazione corticale. Specifici tipi di neuroni sono contrassegnati tramite l’iniezione di traccianti fluorescenti di un neurone retrogradi o l’espressione di proteine fluorescenti in topi transgenici. Campioni di blocco del cervello, per esempio, un emisfero, sono preparati dopo la fissazione, reso trasparenti con tessuto metodi di compensazione e sottoposti a immunolabeling fluorescente dei tipi cellulari specifici. Grandi aree vengono scansionati usando microscopi confocale o due-fotone dotati di grande lavoro distanza obiettivi e fasi motore. Questo metodo può risolvere l’organizzazione periodica dei moduli funzionali di tipo-specific microcolonna di cella nella neocorteccia del mouse. La procedura può essere utile per lo studio di architettura cellulare tridimensionale in aree cerebrali diverse e altri tessuti complessi.
Introduction
La neocorteccia dei mammiferi è composta da un gran numero di tipi di cellule, ognuna con il pattern di espressione genica specifici, proprietà elettrofisiologiche e biochimiche, connessioni sinaptiche, e in vivo funzioni1,2 ,3,4,5,6,7. Se questi tipi di cellule sono organizzati in strutture ripetute è stato poco chiaro. Colonne corticali, comprese le colonne di orientamento visivo e somatosensoriali botti, hanno ripetuto le strutture, ma la loro organizzazione cellulare rimane poco chiaro8,9. Questi sono presenti nelle specifiche aree corticali e non sono un sistema di tutto il cervello.
Nello strato neocortical 5, la grande maggioranza dei neuroni è classificata in quattro tipi principali. Un tipo principale di neuroni eccitatori, neuroni di proiezione Sub-cerebrale, proietta assoni subcortical obiettivi inclusi pons, midollo spinale e il collicolo superiore e, pertanto, rappresenta i principali output corticale via10. Neuroni di proiezione corticale, un altro tipo di neuroni eccitatori, innervano la corteccia10. Neuroni inibitori contengono anche due grandi classi: le cellule che esprimono parvalbumina ed esprimendo la somatostatina11.
Recenti analisi indicano che i tipi di quattro cellule sono organizzati in strutture ripetute12,13,14. Sia sub-cerebrale proiezione neuroni12,13,14 e proiezione corticale neuroni14 organizzare in cellula-tipo microcolonne specifico con un diametro di 1 – 2 celle. Le cellule che esprimono parvalbumina e somatostatina-esprimendo allineare specificamente con microcolonne dei neuroni di proiezione Sub-cerebrale ma non con microcolonne di proiezione corticale neuroni14. Microcolonne stessi allineare periodicamente a forma esagonale della grata di matrice14 e sono presenti in più aree corticali, comprese le zone visivi, somatosensoriali e motori nel cervello del mouse12,14 e in lingua aree del cervello umano13. Neuroni nella microcolonna singolo esibiscono l’attività sincronizzata e avere risposte sensoriali simili14. Queste osservazioni indicano che tipi di cellule strato 5 organizzano in una struttura di reticolo microcolonna che rappresenta l’organizzazione di tutto il cervello nota prima di ripetere moduli funzionali.
Microcolonne hanno un raggio di circa 10 µm e hanno una periodicità spaziale di circa 40 µm. Inoltre, l’orientamento delle microcolonne è parallelo alla loro dendriti apicali e cambia a seconda della loro posizione nella corteccia14. Pertanto, il sistema microcolonna è difficile da analizzare utilizzando fette corticali convenzionale con uno spessore tipico di poche decine di micrometri. Inoltre, l’analisi della periodicità richiede dati tridimensionali da una vasta gamma di aree cerebrali e, pertanto, l’area di imaging tipico di microscopia confocale o in vivo imaging 2-fotone è troppo stretta.
Recentemente, le tecniche sono state sviluppate per deselezionare tessuti spessi15,16. Qui descriviamo l’applicazione di questi metodi per ottenere immagini tridimensionali, su larga scala dei tipi principali delle cellule nello strato neocortical mouse 5 che compongono il sistema microcolonna. Neuroni di proiezione subcerebral sono etichettati dall’etichettatura retrograda o dall’espressione della proteina fluorescente verde avanzata in Crym-egfp topi transgenici12e proiezione corticale neuroni sono etichettati da entrambi il retrogrado etichettatura o dall’espressione del tdTomato Tlx3–cre/Ai9 topi17. Le cellule che esprimono parvalbumina e che esprimono somatostatina sono etichettate da immunohistochemistry. Il metodo (anticorpo scala S) AbScale18 viene utilizzato per l’anticorpo che macchia esperimenti, mentre il metodo SeeDB (vedere cerebrale profonda)19 viene utilizzato per altri esperimenti. Questi metodi superare le suddette difficoltà dei metodi convenzionali di formazione immagine e rivelano l’organizzazione accurata di strato 514.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo presentato le procedure per ottenere immagini tridimensionali su larga scala dell’organizzazione cellulare specifico del tipo dei tipi principali delle cellule nello strato neocortical mouse 5. Rispetto alla fetta convenzionale macchiatura, il metodo è più utile nel determinare l’organizzazione tridimensionale della neocorteccia. Il metodo consente acquisizione immagini dalla più ampia e le regioni del cervello più profonde rispetto al tipico in vivo microscopia 2-fotone o microscopia confocale conve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Atsushi Miyawaki e Hiroshi Hama per i loro consigli sugli esperimenti elAbSca, Charles Yokoyama per l’editing del manoscritto, Eriko Ohshima e Miyuki Kishino per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di ricerca da RIKEN T.H. e localizzativi per ricerca scientifica dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT) del Giappone di T.H. (aree Innovative “Mesoscopiche neurocircuiti”; 22115004) e S.S. (25890023).
Materials
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 | |
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