تقييم وظيفي لمسارات حاسة الشم في المعيشة النمو الضفادع الصغيرة
Summary
النمو الضفادع الصغيرة توفر منبرا فريداً للتحقيق في وظيفة المجراة في الجهاز العصبي. يمكننا وصف منهجيات لتقييم معالجة المعلومات حاسة الشم في معيشة يرقات النمو في ظروف تربية عادية أو بعد الإصابة.
Abstract
النمو الضفادع الصغيرة توفر محفلاً فريداً للتحقيق في وظيفة النظام العصبي. أنها توفر مزايا تجريبية متعددة، مثل إمكانية الوصول إلى العديد من النهج التصوير والتقنيات الكهربية وفحوصات السلوكية. يعتبر نظام حاسة الشم شرغوف النمو وبشكل خاص يناسب للتحقيق في وظيفة نهايات المنشأة خلال التطور الطبيعي أو إصلاحه بعد الإصابة. هنا، يمكننا وصف منهجيات لتقييم معالجة المعلومات حاسة الشم في معيشة يرقات النمو . أننا مخطط مجموعة من القياسات المجراة في الاستجابات بريسينابتيك الكالسيوم في جلوميرولي لمبة شمي مع فحوصات السلوك الموجهة بحاسة الشم. يمكن الجمع بين الأساليب مع ترانسيكشن للأعصاب شمي لدراسة تجديد أسلاك التوصيل متشابك. وتعرض تجارب استخدام الحيوانات المحورة وراثيا والبرية من نوع التعبير عن الصحفيين بروتينات فلورية خضراء في خلايا الجهاز العصبي المركزي. تطبيق النهج المبين للضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا يمكن أن تكون مفيدة لكشف الأسس الجزيئية التي تحدد سلوك الفقاريات.
Introduction
النمو الضفادع الصغيرة تشكل نموذجا حيوانية ممتازة لدراسة وظيفة طبيعية للجهاز العصبي. الشفافية والجينوم الكامل التسلسل1،2، وإمكانية الوصول إلى التقنيات الجراحية والكهربية والتصوير من خصائص فريدة اليرقات النمو التي تسمح للتحقيق في وظائف الخلايا العصبية المجراة في3 . بعض الاحتمالات التجريبية متعددة من هذا الطراز الحيوانية موضحة بدراسات دقيقة أجريت على شرغوف النظم الحسية والحركية4،،من56. دارة العصبية خاصة مناسبة تماما لدراسة جوانب كثيرة لتجهيز على مستوى نهايات المعلومات هو نظام حاسة الشم شرغوف النمو 7. أولاً، الاتصال به متشابك يعرف جيدا: مستقبلات الشم الخلايا العصبية (أورنس) مشروع للمبة شمي وإقامة اتصالات متشابك مع dendrites التاجي/معنقدة الخلايا داخل glomeruli لتوليد خرائط رائحة. ثانيا، ما أورنس باستمرار تولدها الخلايا طوال الحياة للحفاظ على الأداء الوظيفي لمسارات حاسة الشم8. وثالثاً، لأن يظهر نظام حاسة الشم قدرة على التجدد عظيم، النمو الضفادع الصغيرة قادرة تماما إصلاح لمبة شمي بهم بعد التذرية9.
في هذه الورقة، ويصف لنا النهج التي تجمع بين التصوير glomeruli حاسة الشم في معيشة الضفادع الصغيرة مع التجارب السلوكية لدراسة الأداء الوظيفي لمسارات حاسة الشم. واستخدمت أساليب مفصلة هنا للدراسة الفنية استعادة الاتصال الكبيبي في لمبة شمي بعد عصب شمي ترانسيكشن10. البيانات التي تم الحصول عليها في النمو الضفادع الصغيرة ممثل الفقاريات نظراً لتجهيز حاسة الشم التطوري المصانة.
تتمثل الأساليب الموصوفة باستخدام X. tropicalis ولكن يمكن تنفيذها بسهولة في العاشر. ليفيس. وعلى الرغم من حجم أكبر من الكبار X. laevis، كلا من الأنواع تتشابه خلال مراحل شرغوف. تكمن الاختلافات الرئيسية الموجودة على مستوى الجينوم. يعرض X. laevis الفقيرة الصوبة الوراثية، تحدد معظمها بالجينوم اللوتيترابلويد وجيل طويل الوقت (حوالي 1 سنة). وفي المقابل، عاشرا- تروبيكاليس أكثر قابلية للتعديلات الوراثية نظراً للوقت جيل أقصر (5-8 أشهر) والجينوم مثنوية. يتم توضيح التجارب التمثيلية للحيوانات البرية من نوع وثلاثة خطوط مختلفة وراثيا: Hb9:GFP (X. tropicalis)، NBT:GFP (X. tropicalis) و tubb2:GFP (X. laevis).
ينبغي النظر في المنهجيات المبينة في العمل الحالي جنبا إلى جنب مع تقدم الوراثية في مجال النمو . بالبساطة وسهولة تنفيذ التقنيات المعروضة يجعلها مفيدة بشكل خاص لتقييم طفرات سبق شرحه11، فضلا عن خطوط النمو المتولدة عن التكنولوجيا كريسبر-Cas912. كما يصف لنا إجراء العمليات جراحية المستخدمة في قطاع شمي الأعصاب التي يمكن أن تنفذ في أي مختبر وبعد الوصول إلى النمو الضفادع الصغيرة. النهج المستخدمة لتقييم استجابات الكالسيوم presynaptic والسلوك الموجهة بحاسة الشم تتطلب معدات محددة، وأن كانت متوفرة بمعتدلة التكلفة. ترد في نموذج بسيط لتشجيع استخدامها في مجموعات البحث منهجيات ويمكن أن تضع الأسس لفحوصات أكثر تعقيداً بتنفيذ التحسينات أو رابطة للتقنيات الأخرى، أي، نهج نسيجية أو الوراثية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتصف هذه الورقة التقنيات التي مفيدة للتحقيق في الأداء الوظيفي لمسارات حاسة الشم في المعيشة النمو الضفادع الصغيرة. البروتوكول الحالي مفيد بشكل خاص لتلك المختبرات التي تعمل، أو الوصول إلى النمو؛ ومع ذلك، كما أنها مثيرة للاهتمام لهؤلاء الباحثين دراسة الأسس الجزيئية والخلوية لإصل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من ذ ش وزارة الاقتصاد دي كومبيتيتيفيداد (مينيكو؛ SAF2015-63568-R) كوفونديد بالاوروبية الإقليمية تطوير الصندوق (سيطلب)، بجوائز البحوث التنافسية من الزمالة التذكارية فورتيس ف. غ. م. وصندوق الزمالة جورج ستيفن كوفلر، لورا وآرثر كولون وهبت الصيف البحث صندوق الزمالة ، الزمالة فيشباخ، وصندوق الجيل العظيم من المختبر البيولوجي البحري والوطني النمو الموارد RRID:SCR_013731 (وودز هول، ماجستير) حيث أجرى جزء من هذا العمل. ونشكر أيضا برنامج سيركا/محافظة كاتالونيا للدعم المؤسسي. أ. ل. وزميل Húnter سيرا.
Materials
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
References
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
- Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
- Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).
- Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
- Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. 신경과학. 5 (12), 2175-2186 (1980).
- Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
- Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
- Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).
- Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. 발생학. 317 (1), 174-186 (2008).
- Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. 발생학. 426 (2), 325-335 (2017).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
- Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14 (2016).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
- McDiarmid, R., Altig, R. . Tadpoles: The biology of anuran larvae. , 149-169 (1999).
- Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
- Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
- Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).
