生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価
Summary
アフリカツメガエルのオタマジャクシは、体内の神経系の機能を調査するためのユニークなプラットフォームを提供しています。リビングに嗅覚情報処理を評価する方法論について述べるアフリカツメガエル幼生通常飼育条件や外傷後。
Abstract
アフリカツメガエルのオタマジャクシは、神経系の機能を調査するためのユニークなプラットフォームを提供しています。多数のイメージング技術、電気生理学的手法、行動アッセイへのアクセシビリティなど、複数の実験的利点を提供します。アフリカツメガエル幼生の嗅覚系は特に正常な開発の間に確立されたまたは傷害の後改革シナプスの機能を調査するために適しています。ここでは、リビングに嗅覚情報処理を評価する方法論について述べるアフリカツメガエル幼生。嗅覚に基づく行動アッセイと嗅球の糸球体におけるシナプス カルシウム反応の生体内測定の組み合わせの概要を説明します。メソッドは、シナプス接続の配線を検討する嗅神経の断裂と組み合わせることができます。中枢神経系細胞における GFP レポーターを表現する野生型および遺伝子組換え動物を用いる実験を紹介します。遺伝子組換えオタマジャクシに説明した方法の適用は、脊椎動物の動作を定義する分子基盤の解明に役立ちます。
Introduction
アフリカツメガエルのオタマジャクシは、神経系の正常な機能を学習する優れた動物モデルを構成します。神経機能生体内で3 を調査できるようにアフリカツメガエル幼生のユニークな特性を透明性、完全に配列されたゲノム1,2, と外科、電気生理学とイメージング技術へのアクセス.この動物モデルの複数の実験的可能性のいくつかはオタマジャクシ感覚運動系4,5,6に対して徹底的な研究によって説明されます。情報レベル シナプスの処理の多くの側面を研究に特に適して神経回路は、アフリカツメガエルのオタマジャクシの嗅覚系7です。まず、そのシナプスの接続はよく定義された: 嗅覚受容ニューロン (ORNs) プロジェクトの嗅球へと臭気マップを生成する糸球体内の僧帽細胞の樹状突起とシナプスの接触を確立します。第二に、その ORNs は嗅覚経路8の機能を維持するために一生神経によって継続的に生成されます。第三に、アフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚システムは、素晴らしい再生能力を示すが完全切除9後の嗅球を改革することが.
本稿では嗅覚経路の機能を研究する行動実験と生活オタマジャクシで嗅糸球体の画像を結合する方法をについて説明します。ここで詳細な方法は、嗅神経断裂10後の嗅球糸球体接続機能回復の研究に使用されました。嗅覚情報処理の進化は脊椎動物の代表であるアフリカツメガエルのオタマジャクシで得られたデータ保存します。
X. tropicalisを使用して説明する方法を例示されるが、 Xで容易に実装することができます。発生学。大人のX. laevisの大きいサイズにもかかわらず両種は幼生の段階で著しく似ています。主な違いは、ゲノムのレベルで存在します。X. laevisには、allotetraploid のゲノム、長い生成時間 (約 1 年) によって大抵定められる貧しい人々 の遺伝的少ないが表示されます。対照的に、X の性はその短い世代時間 (5-8 ヶ月) と二倍体ゲノムのための遺伝の修正に向いています。代表的な実験は、野生型動物と 3 つの異なる形質転換線に図示されている: Hb9:GFP (X. tropicalis)、NBT:GFP (X. tropicalis)、tubb2:GFP (X. laevis)。
現在の作業に記載されている方法論は、アフリカツメガエルにおいて遺伝的進行と共に考慮されなければなりません。シンプルさと提示の技術の導入が容易になります CRISPR Cas9 技術12によって生成されたアフリカツメガエル行と同様に、既に説明した変異体11を評価する場合に役立ちます。アフリカツメガエル幼生へのアクセスを有するあらゆる研究室で実装できる嗅覚神経を縦断面に使用手術についても述べる。アプローチがシナプス前のカルシウム応答を評価するために使用し、嗅覚に基づく行動が特定の機器を必要とするとはいえ適度な費用でご利用いただけます。方法論研究グループでの使用を促進するために簡単な形式で掲載して、改善を実装することによって、または他の技術、すなわち,組織学的または遺伝学的アプローチへの関連付けによってより複雑なアッセイの拠点を設定することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
リビングで嗅覚経路の機能を調査するために役立つ手法について述べるアフリカツメガエルのオタマジャクシ。現在のプロトコルはアフリカツメガエル; へのアクセス、仕事、またはそれらの研究所にとって特に便利しかし、神経細胞の再生と修復の細胞および分子基盤を調査しているそれらの研究のための興味深いですも。アフリカツメガエルで得られた結果は、され?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、エル Ministerio デ Economía y Competitividad (MINECO; からの補助金によって支えられました。SAF2015-63568-R) M. G. F. Fuortes 記念フェローシップ、スティーブン ・ w ・ Kuffler 奨学基金、ローラ、アーサー Colwin 恵まれて夏研究奨学基金から競争的研究賞によって、欧州地域開発基金 (ERDF) を cofunded、フィッシュバッハ親睦と海洋生物学研究所の、国立アフリカツメガエル リソース RRID:SCR_013731 (森の穴、マサチューセッツ) この仕事の部分が行った偉大な世代ファンド。またセルサ プログラムに感謝/ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ機関サポートのため。アダムローリーはセラ Húnter やつです。
Materials
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
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