تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)
Summary
تحديد التفاعلات الفيزيائية بين الجينات والعناصر التنظيمية الصعبة ولكن قد تيسرت بفضل أساليب التقاط تكيف كروموسوم. هذا التعديل على البروتوكول ج 4-seq يخفف التحيز PCR بالتقليل من التضخيم المفرط لقوالب بكر ويزيد من مابابيليتي لما يلي: عن طريق إدراج خطوة هضم إنزيم التقييد بإضافة.
Abstract
تحديد العناصر التنظيمية لجين هدف معين يشكل تحديا تقنيا كبيرا نظراً للتغير في أحجام العناصر التنظيمية لجينات مستهدفة لتحديد المواقع والتأثير. وقد تم إحراز بعض التقدم مع bioinformatic التنبؤ بوجود والوظيفة لتعديلات جينية الدانية المقترنة بالتعبير الجيني تم تنشيطه باستخدام مواقع الربط عامل النسخ المصانة. الكروماتين تكيف التقاط الدراسات قد أحدثت ثورة في قدرتنا على اكتشاف اتصالات الكروماتين المادية بين متواليات وحتى داخل جينوم أكمله. التقاط تكيف الكروماتين دائرية مقترنة مع الجيل التالي تسلسل (ج 4-seq)، على وجه الخصوص، يهدف إلى اكتشاف التفاعلات المادية الكروماتين كل شيء ممكن لتسلسل معين من الفائدة (وجهة نظر)، مثل جين المستهدف أو هيئة تنظيمية محسن. ج 4-seq الاستراتيجيات الحالية مباشرة تسلسل من داخل وجهة نظر ولكن تتطلب العديد ووجهات النظر المتنوعة تكون متسلسلة في نفس الوقت لتجنب التحديات التقنية الموحدة قاعدة الدعوة (التصوير) مع منصات تسلسل الجيل القادم. قد لا يكون هذا الحجم من التجارب العملية للعديد من المختبرات. هنا، نحن تقرير نهج تعديل بروتوكول ج 4-seq الذي يشتمل على خلاصة إنزيم التقييد إضافي والخطوات التضخيم المستندة إلى قبكر التي تم تصميمها لتسهيل التقاط أكبر من ما يلي تسلسل المتنوعة والتقليل من احتمالات بكر التحيز، على التوالي. لدينا طريقة ج 4 المعدلة قابلة لمختبر البيولوجيا الجزيئية القياسية لتقييم بنية الكروماتين.
Introduction
وقد تيسر تحديد العناصر التنظيمية للتعبير الجيني في المشروع موسوعة عناصر الحمض النووي (ترميز) شاملة المشروح نشاط وظيفي ل 80% من الجينوم البشري1،2. تحديد المواقع في فيفو النسخ عامل ملزم وفرط دناسي، وجينيه هيستون والحمض النووي مثلايشن التعديلات في أنواع الخلايا الفردية مهدت الطريق للتحليلات الوظيفية للمرشح التنظيمية العناصر للتعبير الجيني المستهدف. المسلحة مع هذه النتائج، أننا نواجه التحدي المتمثل في تحديد الترابط الوظيفي بين العناصر التنظيمية والجينات. على وجه التحديد، ما هي العلاقة بين جينات هدف معين ولها enhancer(s)؟ أسلوب الالتقاط (3 ج) المطابقة الكروماتين يتصدى مباشرة لهذا السؤال بتحديد التفاعلات الوظيفية، المادية، ومن المحتمل بين منطقة الاهتمام والمرشح التفاعل تسلسل من خلال أحداث تم التقاطها في الكروماتين الثابتة3 . كما ازداد فهمنا للتفاعلات الكروماتين، ولكن الواضح أن التحقيق المكاني المرشح المختارة غير كافية لتوفير فهم كامل للتفاعلات بين الجينات-محسن. على سبيل المثال، ترميز استخدمت الأسلوب نسخة كربونية (5 ج) القبض على تكيف الصبغية الفائق لدراسة جزء صغير من الجينوم البشري (1%، التجريبية مجموعة من 44 المكاني) وذكرت الترابط المعقد المكاني. الجينات والقدرة على مع التفاعلات التي تم تحديدها في المتوسط مختلف الشركاء المتفاعلة 2 – 4، كان كثير منها مئات كيلوبس بعيداً في الفضاء الخطي4. علاوة على ذلك، من لي، وآخرون. يستخدم “تحليل التفاعل الكروماتين” بالزوجي-نهاية “تسلسل العلامة” (شيا-PET) لتحليل التفاعلات مروج كل الجينوم وتبين أن 65% مواقع الربط الثاني رنا بوليميراز متورطون في التفاعلات الكروماتين. بعض هذه التفاعلات أدت إلى مجمعات كبيرة ومتعددة الجينات التي تمتد مئات كيلوبس المسافة الجينوم والتي تتضمن، في المتوسط، 8-9 الجينات كل5. معا، هذه النتائج تسلط الضوء على الحاجة إلى أساليب كل الجينوم غير منحازة لاستجواب التفاعلات الكروماتين. يتم استعراض بعض هذه الأساليب في شميت وآخرون. 6.
أساليب أكثر حداثة للدراسات التقاط تكيف الكروماتين يقترن بالجيل التالي التسلسل (مرحبا-ج وج 4-seq) تمكين اكتشاف تسلسل غير معروف التفاعل مع منطقة لفائدة6. على وجه التحديد، وضع التقاط تكيف كروموسوم التعميم مع الجيل التالي تسلسل (ج 4-seq) لتحديد مواضع التفاعل مع تسلسل اهتمامها طريقة غير متحيزة7 بتسلسل الحمض النووي من القبض على الكروماتين الدانية منطقة اهتمام في الفضاء ثلاثي الأبعاد. باختصار، هو ثابت الكروماتين للحفاظ على تفاعلاته DNA البروتين الأصلي، المشقوق مع إنزيم التقييد، ومتصلة في وقت لاحق تحت ظروف مخفف لالتقاط بيولوجيا ذات الصلة “التشابك” من التفاعل المكاني (الشكل 1). يتم عكس الروابط عبر إزالة البروتين، مما ترك الحمض النووي متاح للانقسام إضافية مع إنزيم التقييد ثانية. ربط نهائي ينشئ دوائر أصغر من التفاعل المكاني. كبسولة تفجير لتسلسل الفائدة ثم المستخدمة لإنشاء إحدى مكتبات تضخيم تسلسلات غير معروف من الشظايا سيركولاريزيد، تليها المصب تسلسل الجيل القادم.
البروتوكول المعروضة هنا، الذي يركز على إعداد عينة، يجعل من التعديلات الرئيسية اثنين إلى القائمة ج 4-seq أساليب8،9،10،،من1112. أولاً، فإنه يستخدم أسلوب المستندة إلى qPCR تجريبيا تحديد العدد الأمثل للتضخيم دورات لخطوات إعداد مكتبة ج 4-seq ومما يخفف احتمال التحيز PCR النابعة من التضخيم المفرط للمكتبات. ثانيا، يستخدم خطوة هضم قيود إضافية في محاولة للحد من توحيد تسلسل المعروفة “الطعم” الذي يعوق الدعوة قاعدة دقيقة بتسلسل الصك، ويعظم تسلسل فريدة من نوعها، غنية بالمعلومات ومن ثم، في كل عملية قراءة. بروتوكولات أخرى الالتفاف حول هذه المسألة عن طريق تجميع العديد من المكتبات seq ج 4-8 (12-15) مع تسلسل الطعم مختلفة و/أو تقييد مواقع، وحدة تخزين من التجارب التي قد لا تكون قابلة للتحقيق بمختبرات أخرى. تسمح التعديلات المعروضة هنا عدد قليل من التجارب، عينات، و/أو يعيد فهرسة وتجميع في ممر واحد.
Protocol
Representative Results
Discussion
نتائج ج 4 لديها القدرة على الكشف عن التفاعلات الكروماتين يمكنه التعرف على العناصر التنظيمية لم تكن معروفة سابقا و/أو الجينات المستهدفة التي تعتبر مهمة في25،24،سياق البيولوجي محددة26. ومع ذلك، قد تحد من عقبات فنية البيانات المستقاة من هذه ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل نيامس (R01AR065523).
Materials
| HindIII | NEB | R0104S | |
| CviQI | NEB | R0639S | |
| DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
| Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Nutator | VWR | 15172-203 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
| Benchtop centrifuge | |||
| Refrigerated microcentrifuge | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| 20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover slips | VWR | 16004-094 | |
| Light microscope | |||
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Shaking heat block | |||
| 2M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
| qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
| Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
| PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
| 1M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
| Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
| Spectrophotometer | |||
| Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| ROX | BioRad | 172-5858 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
| SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
| Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
| UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
References
- Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, (2012).
- Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
- Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
- Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
- Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
- Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
- Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
- Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
- Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
- Williams, R. L., et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
- McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
- Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
- Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
- Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).
