基因和调控元素之间的物理相互作用的识别是具有挑战性的, 但已被染色体构象捕获方法所促进。这种对 4 c 序列协议的修改可以减少 pcr 模板的过度放大, 并通过加入限制酶消化步骤来最大限度地提高 mappability 的读数。
由于调控元素对目标基因的定位和作用大小的变化, 确定特定目标基因的调控元素构成了重大的技术挑战。通过保守转录因子结合位点的生物信息学预测与活化基因表达相关的近表观遗传修饰的存在和功能, 取得了一些进展。染色质构象捕获研究已经改变了我们的能力, 发现在序列之间的物理染色质接触, 甚至在整个基因组。环形染色质构象捕获与下一代测序 (4 c 序列), 特别是设计, 以发现所有可能的物理染色质相互作用的特定序列的利益 (观点), 如目标基因或监管增强。目前的 4 c 序列策略直接从视点内排列, 但需要多个不同的视点同时进行排序, 以避免与下一代测序平台一致的基调用 (成像) 技术难题。这一量的实验对许多实验室来说可能并不实际。在这里, 我们报告了一个改进的方法, 4 c 序列协议, 包括了额外的限制酶文摘和基于 qPCR 的放大步骤, 旨在促进更大的捕获不同的序列读取和减少可能的PCR 偏倚, 分别。我们修改后的4C 方法适合于标准分子生物学实验室评估染色质体系结构。
DNA 元素百科全书 (编码) 项目为人类基因组1、280% 的功能活动提供了综合注解, 从而促进了基因表达的调控元素的识别。在体内转录因子结合, DNaseI 过敏, 和表观组蛋白和 DNA 甲基化修饰的个体细胞类型的地点的鉴定为候选调控的功能分析铺平了道路。目标基因表达的元素。有了这些发现, 我们面临着确定调控元素和基因之间功能互联的挑战。具体来说, 一个给定的目标基因和它的增强剂之间的关系是什么?染色质构象捕获 ( 3C ) 方法通过在固定染色质 3 中通过捕获的事件识别一个感兴趣区域和候选交互序列之间的物理和可能的功能互 , 直接解决这个问题 ..然而, 随着我们对染色质相互作用的理解增加, 显然, 对预选候选基因座的调查不足以提供对基因增强器相互作用的完全理解。例如, 编码使用高通量染色体构象捕获碳拷贝 (5C) 方法来检查人类基因组的一小部分 (1%, 44 个基因座的先导集), 并报告了基因座的复杂互联。基因和促进剂与确定的相互作用平均2–4不同的相互作用的伙伴, 其中许多是数以百计的 kilobases 离开在线性空间4。还有, 李等。采用配对端标记测序 (嘉-PET) 进行染色质相互作用分析, 分析全基因组启动子相互作用, 发现65% 的 RNA 聚合酶 II 结合部位参与了染色质的相互作用。其中一些相互作用导致大, 多基因复合体横跨数以百计的 kilobases 基因组距离和包含, 平均, 8-9 个基因每5。这些发现结合在一起, 强调需要无偏全基因组方法来审问染色质相互作用。其中一些方法在施密特和al中进行了评述。6。
最近的染色质构象捕获研究方法, 加上下一代测序 (高 c 和 4 C 序列), 使发现未知数列与感兴趣的区域6。具体来说, 用下一代测序 (4 c 序列) 建立环状染色体构象捕获, 以以无偏见的方式7通过测序 DNA 从近距离捕获的染色质到3D 空间感兴趣的区域。简要地说, 染色质是固定的, 以保持其原生蛋白-DNA 相互作用, 与限制酶, 并随后结扎在稀释条件下, 以捕获生物学相关的 “缠结” 的相互作用的基因座 (图 1)。交叉链接被逆转, 以去除蛋白质, 从而留下的 DNA 可用于额外的分裂与第二限制酶。最后的结扎会产生更小的相互作用的圆圈。然后用引物对感兴趣的序列进行生成, 从发送的片段中产生未知序列的放大库, 其次是下游下一代测序。
此处提出的关于样本准备的协议对现有的4种 c 序列方法8、9、10、11、12进行了两项重大修改。首先, 它使用一种基于 qPCR 的方法来经验主义地确定 4 c 序列库准备步骤的最佳放大周期数, 从而减少了由于图书馆过度扩增而导致的 PCR 偏倚的可能性。其次, 它使用额外的限制摘要步骤, 努力减少已知的 “诱饵” 序列的一致性, 这会阻碍测序仪精确地进行基调用, 从而使每读中的唯一信息序列最大化。其他协议通过将许多 (12-15)8 4 c 序列库与不同的诱饵顺序和/或限制站点汇集在一起来规避这个问题, 这是其他实验室可能无法实现的大量实验。此处所做的修改允许少量的实验、样本和/或复制被编入索引, 并汇集到一个单独的车道中。
4C 结果有可能揭示染色质相互作用, 可以识别以前未知的调控元素和/或目标基因是重要的在特定的生物环境24,25,26。然而, 技术障碍可能会限制从这些实验获得的数据。在4C 协议中, 模板过度放大引起的 PCR 偏倚很可能。该协议通过利用 qPCR 来确定最佳的放大周期数以客观的方式来解决这个问题。此外, 通过限制文摘从扩增的反?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了结缔组织国立研究院 (R01AR065523) 的支持。
HindIII | NEB | R0104S | |
CviQI | NEB | R0639S | |
DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Nutator | VWR | 15172-203 | |
Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
Benchtop centrifuge | |||
Refrigerated microcentrifuge | |||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Cover slips | VWR | 16004-094 | |
Light microscope | |||
Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
Shaking heat block | |||
2M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
Proteinase K | NEB | P8107S | |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
1M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
Spectrophotometer | |||
Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
ROX | BioRad | 172-5858 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |