High-throughput Identification des séquences régulatrices du gène à l’aide de prochaine génération séquençage du Chromosome circulaire Conformation Capture (4C-seq)
Summary
L’identification des interactions physiques entre les gènes et les éléments de régulation est difficile, mais a été facilitée par les méthodes de capture de conformation du chromosome. Cette modification du protocole 4C-seq atténue la partialité de la PCR en réduisant au minimum l’amplification excessive des modèles PCR et maximise la mappability se lit en y incorporant une étape digest d’enzyme de restriction addition.
Abstract
L’identification des éléments de régulation pour un gène cible donnée constitue un défi technique considérable en raison de la variabilité dans les tailles de positionnement et de l’effet des éléments régulateurs à un gène cible. Certains progrès ont été réalisés avec la prédiction de bioinformatique de l’existence et la fonction de modifications épigénétiques proximales, associée à l’expression des gènes activés à l’aide de sites de fixation de facteurs de transcription conservée. Études de chromatine conformation capture ont révolutionné notre capacité à découvrir des contacts physiques chromatine entre les séquences et même au sein d’un génome entier. Capture de conformation de la chromatine circulaire couplé avec la nouvelle génération séquençage (4C-seq), en particulier, est conçu pour découvrir tous les possibles interactions de chromatine physique pour une séquence donnée d’intérêt (point de vue), par exemple un gène cible ou une réglementation Enhancer. Les stratégies actuelles de 4c-seq directement partir de séquence au sein du point de vue mais pour lesquels nombreux et divers points de vue à séquencer simultanément afin d’éviter les difficultés techniques de l’uniforme de base aux prochaines plates-formes de séquençage appelant (imagerie). Ce volume d’expériences n’est peut-être pas pratique pour de nombreux laboratoires. Nous rapportons ici une approche modifiée du protocole 4C-seq qui incorpore un digest de l’enzyme de restriction supplémentaire et étapes de qPCR-fonction amplification qui sont conçus pour faciliter une saisie plu de séquences diverses lectures et atténuer les risques de Biaiser les PCR, respectivement. Notre méthode modifiée de 4c se prête au laboratoire de la biologie moléculaire standard pour évaluer l’architecture de la chromatine.
Introduction
L’identification des éléments de régulation de l’expression des gènes a été facilitée par le projet d’encyclopédie des éléments de l’ADN (Encoder) qui annotée complète l’activité fonctionnelle de 80 % du génome humain1,2. L’identification des sites pour en vivo liaison de facteur de transcription, hypersensibilité de la DNase i et histone épigénétique et modifications de méthylation de l’ADN dans les cellules individuelles a ouvert la voie pour les analyses fonctionnelles du candidat réglementaire éléments pour l’expression des gènes cibles. Armé de ces résultats, nous sommes confrontés au défi de la détermination de l’interconnectivité fonctionnelle entre gènes et des éléments de régulation. Plus précisément, quelle est la relation entre un gène cible donnée et son enhancer(s) ? La méthode de capture (3C) de conformation de la chromatine répond directement à cette question par identification les interactions fonctionnelles, physiques et probables entre une région d’intérêt et candidat interagissant les séquences à travers les événements capturés dans la chromatine fixe3 . Comme notre compréhension des interactions de la chromatine a augmenté, cependant, il est clair que l’enquête de locus de candidats présélectionnés ne suffit pas fournir une compréhension complète des interactions gène-enhancer. Par exemple, ENCODE utilisé la méthode de copie carbone (5C) haut débit chromosomiques conformation capture pour examiner une petite partie du génome humain (1 %, pilote mis de 44 loci) et rapportée interconnexion complexe des loci. Gènes et rehausseurs avec interactions identifiées en moyenne 2 à 4 différents partenaires interdépendants, dont beaucoup étaient des centaines de kilobases loin dans l’espace linéaire4. En outre, Li et al. utilisé la chromatine analyse des interactions en bout appariés Tag séquençant (clerbois-PET) pour analyser les interactions de promoteur du génome entier et trouvé que 65 % de l’ARN polymérase II accepteurs étaient impliqués dans les interactions de la chromatine. Certaines de ces interactions résultèrent en grands, multi-gene complexes s’étendant sur des centaines de kilobases de distance génomique et contenant, en moyenne, 8-9 gènes chaque5. Ensemble, ces résultats soulignent la nécessité de méthodes de génome entier impartiales pour interroger les interactions de la chromatine. Certaines de ces méthodes sont examinés dans Schmitt et al. 6.
Des méthodes plus récentes études de chromatine conformation capture couplé avec génération séquençage (Hi-C et 4C-seq) activer la découverte de séquences inconnues interagissant avec une région d’intérêt6. Plus précisément, chromosome circulaire conformation capture avec génération de séquençage (4C-seq) a été développée pour identifier les locus interagissant avec une séquence d’intérêt dans une manière impartiale7 par séquençage ADN de chromatine capturée proximale à la région d’intérêt dans l’espace 3D. En bref, la chromatine est fixée à préserver ses interactions protéine-ADN natif, s’est fendue avec une enzyme de restriction et ensuite ligaturé conditions diluées pour capturer biologiquement pertinentes « enchevêtrements » d’interaction loci (Figure 1). Les liaisons transversales sont inversées pour enlever les protéines, laissant ainsi l’ADN disponible par clivage supplémentaire avec une deuxième enzyme de restriction. Une ligature finale génère des petits cercles de loci qui interagissent. Amorces pour la séquence d’intérêt sont ensuite utilisés pour générer une bibliothèque amplifiée de séquences inconnues des fragments ΦH1, suivies de séquençage en aval de génération suivant.
Le protocole présenté ici, qui met l’accent sur la préparation de l’échantillon, fait deux modifications majeures existantes 4C-seq méthodes8,9,10,11,12. Tout d’abord, il utilise une méthode axée sur le qPCR empiriquement déterminer le nombre optimal d’amplification des cycles pour les étapes de préparation de bibliothèque 4C-seq et atténue ainsi les risques de biais PCR découlant de l’amplification excessive des bibliothèques. Ensuite, il utilise une restriction supplémentaire condensé étape dans un effort pour réduire l’uniformité des séquences connues « appâts » qui entrave d’appel base précise par l’instrument de séquençage et, donc, optimise la séquence unique et informative à chaque lecture. Autres protocoles de contournent ce problème en mettant en commun de nombreuses bibliothèques de 4c-seq8 (12-15) avec appât différentes séquences et/ou des sites de restriction, un volume d’expériences qui ne peut être réalisable par d’autres laboratoires. Les modifications présentées ici laisser un petit nombre d’expériences, des échantillons ou réplique pour être indexé et regroupés en une seule voie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Résultats 4C sont susceptibles de révéler des interactions de la chromatine qui identifient les éléments réglementaires précédemment inconnus et/ou des gènes de cible qui sont importantes dans un contexte biologique spécifique24,25,26. Cependant, les obstacles techniques peuvent limiter les données obtenues de ces expériences. Biais PCR découlant de l’amplification excessive de modèle dans les protocoles de 4 C e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NIAMS (R01AR065523).
Materials
| HindIII | NEB | R0104S | |
| CviQI | NEB | R0639S | |
| DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
| Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Nutator | VWR | 15172-203 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
| Benchtop centrifuge | |||
| Refrigerated microcentrifuge | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| 20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover slips | VWR | 16004-094 | |
| Light microscope | |||
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Shaking heat block | |||
| 2M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
| qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
| Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
| PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
| 1M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
| Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
| Spectrophotometer | |||
| Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| ROX | BioRad | 172-5858 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
| SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
| Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
| UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
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