Identifiering av fysiska interaktioner mellan gener och reglerande element är utmanande men har underlättats med kromosomen konformation fånga metoder. Denna ändring av protokollet 4C-seq mildrar PCR partiskhet genom att minimera överdriven amplifiering av PCR-mallar och maximerar mappability av läser genom att införliva ett tillägg restriktionsenzym digest steg.
Identifiering av reglerande element för en given målgenen utgör en betydande teknisk utmaning på grund av variationen i positionering och effekt storlekar av reglerande element till en målgenen. Vissa framsteg har gjorts med bioinformatiska förutsägelse av förekomsten och funktion av proximala epigenetiska förändringar associerade med aktiverade genuttryck med bevarade transkription faktorn bindningsställen. Kromatin konformation fånga studier har revolutionerat vår förmåga att upptäcka fysiska kromatin kontakter mellan sekvenser och även inom en hela arvsmassa. Cirkulär kromatin konformation capture tillsammans med nästa generations sekvensering (4C-seq), i synnerhet syftar till att upptäcka alla möjliga fysiska kromatin interaktioner för en viss sekvens av intresse (synvinkel), såsom en målgenen eller en reglerande förstärkare. Nuvarande 4C-seq strategier direkt sekvens ur inom utsiktspunkten men kräver många och skiftande synpunkter till sekvenseras samtidigt för att undvika de tekniska utmaningarna med enhetlig bas ringer (imaging) med nästa generations sekvensering plattformar. Denna volym av experiment kan inte vara praktiskt för många laboratorier. Här rapporterar vi en annorlunda metod i 4C-seq-protokollet som omfattar både en ytterligare restriktionsenzym digest och qPCR-baserade förstärkning steg som är utformade för att underlätta en större fångst av olika sekvens läsningar och minska risken för PCR bias, respektive. Vår modifierade 4C metod är mottagliga för standard molekylärbiologi labbet för att bedöma kromatin arkitekturen.
Identifiering av reglerande element för genuttryck har underlättats av det encyklopedi av DNA element (koda) projekt som utförligt kommenterade funktionell aktivitet för 80% av det mänskliga genom1,2. Identifiering av platserna för i vivo transkription faktorn bindande, DNaseI överkänslighet, och epigenetiska Histon och DNA metylering ändringar i enskilda celltyper banade väg för de funktionella analyserna av kandidat föreskrivande element för målet genuttryck. Beväpnad med dessa fynd, står vi inför utmaningen att fastställa den funktionella sammankopplingen mellan reglerande element och gener. Specifikt, vad är förhållandet mellan en viss målgenen och dess enhancer(s)? Metoden kromatin konformation capture (3C) behandlar direkt denna fråga av identifierande fysiska och sannolikt funktionell, interaktioner mellan en region av intresse och kandidat interagerar sekvenser genom fångade händelserna i fasta kromatin3 . Som vår förståelse av kromatin interaktioner har ökat, men är det klart att utredningen av förvalda kandidat loci är otillräckliga för att ge en fullständig förståelse av gen-enhancer interaktioner. Till exempel koda används metoden hög genomströmning kromosomala konformation fånga carbon copy (5C) för att undersöka en liten del av det mänskliga genomet (1%, pilot uppsättning 44 loci) och rapporterade komplexa sammankoppling av loci. Gener och förstärkare med identifierade interaktioner i genomsnitt 2 – 4 olika samverkande partners, varav många var hundratals kilobases bort i linjärt rum4. Ytterligare, Li et al. används kromatin interaktion analys av Paired-End Tag sekvensering (ChIA-PET) att analysera helgenom-promotorn interaktioner och fann att 65% av RNA-polymeras II bindningsställen involverades i kromatin interaktioner. Några av dessa interaktioner resulterade i stora, flera gen komplex som spänner över hundratals kilobases av genomisk avstånd och innehåller, i genomsnitt 8-9 gener varje5. Tillsammans, belysa dessa fynd behovet av opartisk helgenom-metoder för förhör kromatin interaktioner. Några av dessa metoder granskas i Schmitt et al. 6.
Nyare metoder för kromatin konformation fånga studier tillsammans med nästa generations sekvensering (Hi-C och 4C-seq) Aktivera upptäckten av okända sekvenser interagerar med ett område av intresse6. Specifikt, cirkulär kromosom konformation capture med nästa generations sekvensering (4C-seq) har utvecklats för att identifiera loci interagerar med en sekvens av intresse i ett opartiskt sätt7 genom att sekvensera DNA från fångade kromatin proximalt i regionen av intresse i 3D-rymden. Kromatin är kort, fast att bevara dess infödda protein-DNA interaktioner, klyvs med ett restriktionsenzym och därefter sammanskrivna utspädd villkor att fånga biologiskt relevanta ”trassel” samverkande loci (figur 1). De arga länkarna återförs för att ta bort proteinet, vilket lämnar DNA som är tillgängliga för ytterligare klyvning med ett andra restriktionsenzym. En sista ligering genererar mindre cirklar samverkande loci. Grundfärger till sekvensen av intresse används sedan för att generera ett förstärkt bibliotek av okända sekvenser från circularized fragment, följt av nedströms nästa generations sekvensering.
Det protokoll som presenteras här, som fokuserar på provberedning, gör två stora ombyggnader till befintliga 4C-seq metoder8,9,10,11,12. Först, den använder en qPCR-baserad metod att empiriskt fastställa det optimala antalet förstärkning cykler för 4C-seq bibliotek förberedelser och därmed mildrar potentialen för PCR-bias som härrör från överdriven amplifiering av bibliotek. För det andra, används en ytterligare begränsning digest steg i ett försök för att minska likformigheten av kända ”bete” sekvenser som hindrar korrekt bas-ringer av instrumentet sekvensering och, därmed, maximerar unika, informativ sekvensen i varje Läs. Andra protokoll kringgå problemet genom att samla många (12-15)8 4 C-seq bibliotek med olika bete sekvenser eller begränsning platser, en volym experiment som inte kanske kan uppnås av andra laboratorier. De ändringar som presenteras här kan ett litet antal experiment, prover eller replikerar att indexeras och sammanslagna till en enda lane.
4C resultat har potential att avslöja kromatin interaktioner som kan identifiera tidigare okända reglerande element och/eller målgener som är viktiga i ett specifikt biologiska sammanhang24,25,26. Tekniska hinder får dock begränsa de uppgifter som erhålls från dessa experiment. PCR-bias som härrör från överdriven amplifiering av mallen i 4 C protokoll är sannolikt. Detta protokoll åtgärdar detta problem genom att …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av NIAMS (R01AR065523).
HindIII | NEB | R0104S | |
CviQI | NEB | R0639S | |
DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Nutator | VWR | 15172-203 | |
Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
Benchtop centrifuge | |||
Refrigerated microcentrifuge | |||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Cover slips | VWR | 16004-094 | |
Light microscope | |||
Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
Shaking heat block | |||
2M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
Proteinase K | NEB | P8107S | |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
1M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
Spectrophotometer | |||
Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
ROX | BioRad | 172-5858 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |