Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)
Summary
Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.
Abstract
Verilen hedef gen düzenleyici elemanlarının tanımlaması için bir hedef gen düzenleyici elemanlarının konumlandırma ve etkisi boyutları değişkenlik nedeniyle önemli bir teknik sorun teşkil etmektedir. Bazı bioinformatic tahmin varlığı ve proksimal korunmuş transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri kullanarak aktif gen ekspresyonu ile ilişkili epigenetik değişiklikler fonksiyonu ile ilerlemeler kaydedilmiştir. Kromatin conformation yakalama çalışmaları yeteneğimizi fiziksel kromatin kişiler dizileri arasında ve tüm bir genom içinde bile keşfetmek için devrim. Dairesel kromatin conformation yakalama (4 C-seq), yeni nesil sıralama ile birleştiğinde özellikle, belirli bir sıra için olası tüm fiziksel kromatin etkileşimler (bakış), ilgi keşfetmek için bir hedef gen veya bir düzenleyici gibi tasarlanmıştır geliştirici. Geçerli 4C-seq stratejileri doğrudan bakış açısı içinde sıra ama çok sayıda gerektiren ve aynı anda üniforma teknik sorunları önlemek için sıralı için farklı bakış açıları (görüntüleme) arama sonraki nesil sıralama platformları ile baz. Bu birimin deney birçok laboratuarlar için pratik olmayabilir. Burada, bir ek Restriksiyon enzimi Özet ve farklı sıra okuma büyük bir yakalama kolaylaştırmak ve olasılığını azaltmak için tasarlanmış qPCR tabanlı amplifikasyon adımları içermektedir 4 C-seq protokolü için değiştirilmiş bir yaklaşım raporu PCR önyargı, anılan sıraya göre. Bizim tarihinde 4C mükellef kromatin mimari değerlendirmek için standart moleküler biyoloji laboratuarında yöntemidir.
Introduction
Gen ekspresyonu için düzenleyici elemanlarının tanımlaması tarafından kapsamlı bir şekilde insan genomu1,%280’i için fonksiyonel etkinlik açıklamalı DNA ansiklopedi öğelerini (kodlama) proje kolaylaştırdı. Vivo transkripsiyon faktörü bağlama, DNaseI aşırı duyarlılık ve epigenetik histon ve tek hücre türleri olarak DNA metilasyonu değişiklikleri için sitelerin kimlik fonksiyonel analizleri aday düzenleyici açtı öğeler için hedef gen ekspresyonu. Bu bulgular ile silahlı, biz düzenleyici elemanlarının ve genler arasındaki işlevsel Birleştiricisi belirleme sorun ile karşı karşıya olan. Özellikle, belirli hedef gen ve onun enhancer(s) ilişkisi nedir? Kromatin conformation yakalama (3C) yöntemi doğrudan bir bölge ilgi ve etkileşim dizileri ile yakalanan olayların sabit kromatin3 aday arasında tanımlayıcı fiziksel ve büyük olasılıkla fonksiyonel, etkileşimler tarafından bu soru adresleri . Etkileşimleri kromatin anlayışımız olarak, ancak, bu önceden seçilmiş aday loci incelenmesi gen-artırıcı etkileşimleri tam bir anlayış sağlamak yetersiz olduğu açıktır. Örneğin, kodla insan genomu (44 loci ayarla % 1, pilot) küçük bir bölümünü incelemek için kullanılan yüksek üretilen iş kromozom conformation yakalama karbon kopya (5 C) yöntem ve karmaşık Birleştiricisi loci bildirdi. Genler ve arttırıcılar ile tanımlanan etkileşimleri birçoğu kilobases doğrusal alanı4uzaklıkta bulunan yüzlerce edildi 2 – 4 farklı etkileşen ortakları ortalama. Ayrıca, Li ve ark. Çiftli-bitiş etiketi sıralama (çim) göre kromatin etkileşimi analiz bütün-genom organizatörü etkileşimleri analiz ve RNA polimeraz II bağlayıcı siteleri % 65’i kromatin etkileşimleri dahil bulundu için kullanılır. Bu etkileşimler bazıları büyük, çok gen kompleksleri kilobases genomik mesafe ve içeren, ortalama olarak, yüzlerce spanning her58-9 genler sonuçlandı. Birlikte, bu bulgular kromatin etkileşimleri sorguya tarafsız bütün-genom yöntemleri ihtiyacını vurgulamak. Bu yöntemlerden bazıları Schmitt ve arkiçinde incelenir. 6.
Kromatin conformation yakalama çalışmaları için daha yeni yöntemler bilinmeyen dizileri faiz6bölge ile etkileşim keşfi yeni nesil (Hi-C ve 4 C-seq) sıralama etkinleştir ile birleştiğinde. Özellikle, yeni nesil sıralama (4C-seq) ile dairesel kromozom conformation yakalama yakalanan kromatin proksimal için gelen DNA sekanslama tarafından bir tarafsız şekilde7 ilgi bir dizi ile etkileşim loci tanımlamak için geliştirilmiştir 3B alanda ilgi bölgesi. Kısaca, kromatin Restriksiyon enzimi ile i ciddi ve daha sonra etkileşen loci (Şekil 1) biyolojik ilgili “düğüm” yakalamak için sulu şartlarda bakmaksızın onun yerli protein-DNA etkileşimleri korumak için sabittir. Çapraz bağlantılar böylece ek bölünme için kullanılabilir DNA ile ikinci bir Restriksiyon enzimi bırakarak protein kaldırmak için tersine çevrilir. Son ligasyonu etkileşen loci daha küçük daireler oluşturur. Astar ilgi sıralaması için daha sonra aşağı akım sonraki nesil sıralama tarafından takip circularized parçaları, bilinmeyen sıralarının güçlendirilmiş bir kütüphane oluşturmak için kullanılır.
Numune hazırlama üzerinde duruluyor, burada anlatılan Protokolü varolan 4 C-seq yöntemleri8,9,10,11,12iki önemli değişiklikler yapar. İlk olarak, ampirik olarak amplifikasyon en uygun sayısı 4 C-seq Kütüphane hazırlık adımları için döngüleri ve böylece kitaplıkları aşırı amplifikasyon dallanma PCR önyargı olasılığını açığının belirlemek için qPCR tabanlı yöntemi kullanır. İkinci olarak, bu bir ek kısıtlama Özet adım bir çaba doğru Bankası-tarafından sıralama enstrüman arama engel ve dolayısıyla, benzersiz, bilgilendirici sırası her okuma en üst düzeye çıkarır bilinen “yem” dizileri tekdüzelik azaltmak için kullanılır. Diğer iletişim kuralları bu sorun birçok (12-15)8 4 C-seq kitaplıklar farklı yem dizileri ve/veya kısıtlama siteleri, diğer laboratuvarlar tarafından ulaşılabilir olmayabilir deneyler hacmi ile havuzu tarafından aşmak. Burada sunulan değişiklikler izin ver deneyler, az sayıda örnekleri ve/veya dizin ve bir tek şeride havuzlu çoğaltır.
Protocol
Representative Results
Discussion
4C sonuçları önceden bilinmeyen düzenleyici elemanlarının tanımlayabilirsiniz kromatin etkileşimleri ve/veya bir belirli biyolojik bağlamda24,25,26yılında önemli hedef genleri ortaya potansiyeline sahip. Ancak, teknik engellerin Bu deneylerden elde edilen veriler sınırlayabilir. 4 C protokolleri şablonunda aşırı amplifikasyon kaynaklanan PCR önyargı olasıdır. Bu iletişim kuralı döngüleri amplifikasyon e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIAMS (R01AR065523) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| HindIII | NEB | R0104S | |
| CviQI | NEB | R0639S | |
| DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
| Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Nutator | VWR | 15172-203 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
| Benchtop centrifuge | |||
| Refrigerated microcentrifuge | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| 20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover slips | VWR | 16004-094 | |
| Light microscope | |||
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Shaking heat block | |||
| 2M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
| qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
| Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
| PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
| 1M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
| Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
| Spectrophotometer | |||
| Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| ROX | BioRad | 172-5858 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
| SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
| Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
| UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
References
- Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, (2012).
- Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
- Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
- Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
- Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
- Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
- Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
- Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
- Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
- Williams, R. L., et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
- McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
- Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
- Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
- Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).
