핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

요약

이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.

초록

핵의 기계적 속성 응답 세포에서 생성 된 기계적인 힘을 결정 합니다. 핵 분자로 골격과 연속 이므로 메서드 부착 세포의 기계적 동작을 필요 합니다. 여기, 우리가 살아있는 부착 세포에서 핵에 직접 힘을 적용 하는 도구로 직접 힘 프로브 (DFP) 토론. 우리는 흡입과 핵 표면에 좁은 micropipette를 연결합니다. micropipette는 변형 하 여 번역 핵 핵 거리 변환 됩니다. 복원 힘은 흡입 힘, 핵 분리 되 고 탄력적 이완. 흡입 압력을 정확 하 게 알려져 있다, 때문에 핵 표면에 강제로 알려져 있다. 이 메서드는 나노 스케일 세력 변형 및 부착 세포에서 핵을 번역 하기에 충분 되며 저항 세력에 핵을 사용할 수 있는 cytoskeletal 요소를 식별 밝혔다. DFP는 살아있는 세포에서 핵 기계적 속성의 구성 요소 세포질과 핵의 기여를 해 부를 사용할 수 있습니다.

서론

암과 같은 병 리 핵 모양 및 구조^1,2, 일반적으로 동반 된다 핵^3,4의 '연'을 변경 포함 됩니다. 기계적 변형에 저항을 핵은 고립 된 핵⁵에 힘을 적용 하 여 일반적으로 특징 되었습니다.

셀에 핵 분자로 링커의 Nucleoskeleton와 골격 (링컨) 복잡 한^6,7,,89골격에 연결 됩니다. 그 결과, 골격과, 세포 층 유착, 세포 외 매트릭스를 통해 핵 기계적으로 통합 되었습니다. 기계적으로 부착 세포 안에 핵을 프로 빙이 기계적 통합에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 살아있는 세포에서 핵을 조작 하는 메서드는 micropipette 포부^10,11및....

프로토콜

1. 영상에 대 한 셀을 준비합니다.

참고: 직접 힘 프로브 (DFP) 모든 부착 셀 형식에 사용할 수 있습니다. 여기, NIH 3T3 마우스 fibroblasts 모델 셀 라인으로이 프로토콜에 대 한 사용 됩니다.

1. 문화 NIH 3T3 fibroblast 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 1%와 10% 기증자 소 혈 청 보충 페니실린-스 35 m m 유리 하단에 원하는 confluency까지 요리. 37 ° C, 5% CO₂세포를 유지 합니다.
   1. NIH 3T3 세포 이미징 뿌리기 전에 모든 35 mm 유리 하단 요리 fibronectin (또는 유사한 ECM 단백질), 5 µ g/mL와 코트를 해야 합니다.
      참고: 셀 해야 합니다 수 완전히 확산 및 실험에 대 한 접시에 부착. DFP 메서드가 작동 하려면 confluency 측면에서 제약 되지 않습니다.
2. 실험 직전 셀 완전 한 성장 매체를 가진 단일 세척 뒤 PBS로 두번 세척.
3. 유리 하단 접시에 완전 한 성장 매체의 3 mL를 추가 합니다.

2. 현미경 및 이미지 수집

결과

그림 2A 는 NIH 3T3 마우스 구와 핵의 강제로 보여줍니다. Micropipette 팁은 오른쪽에 번역, 핵 변형 하 고 결국 micropipette 팁에서 분리. 핵의 길이 변형 흡입 힘 (그림 2B) 증가 함께 증가를 볼 수 있다. 핵 (micropipette 당기는 가장자리)의 앞쪽 가장자리 핵 돌출을 형성 하 고 후행 가장자리 그것의 원래 위치에서 난민. 돌출의 길이 후행 가장자리 변위 (그림 2C), 핵 및 주변 세포질 간의 긴밀 한 통합을 제안 보다 훨씬 큽니다. 시간의 척도 핵 앞쪽 가장자리의 짧은 휴식 (< 1 s), 그리고 핵 뒷면 가장자리 (< 2 s) (그림 2D).

토론

어느 고립 된 핵 (핵은 골격에서 분리)를 필요로 하기 때문에 micropipette 포부¹⁶, 등 최신 방법에 대 한 도전 이다 골격 가진 핵의 기계적 통합 측정 또는 일시 중단 된 셀 (견인 힘, 같은 세포 외 세력 있는 결 석)에 핵. 강제로 막^17,18; 세포 점착에 biaxial 긴장을 적용 하 여 핵에 적용 된 그러나,이 기술은 핵에 힘 불명 하다는 사실에 의해 제한 됩니다. 원자 힘 현미경 (AFM) 프로브; 그대로 셀에 핵을 사용 장점은 그들이 동안 핵의 기계적 성질을 공개 골격와 통합이 제공 합니다. 핵^12,,1314대상이 기존 vivo에서 기술에 추가 하려면, 우리는 그것 동안 살아있.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
FluoroDish	WPI	FD35
SYTO 59	ThermoFisher Scientific	S11341
펨토팁스	Eppendorf	930000043
InjectMan NI2	Eppendorf	NA	단종, 현재 동급모델: InjectMan 4
FemtoJet	Eppendorf	NA	현재 모델 FemtoJet 4i
Plan Fluor oil immersion 40x	Nikon	NA
Apo TIRF oil immersion 60x	Nikon	NA
Donor Bovine Serum (DBS)	ThermoFisher 과학적	16030074	NIH 3T3 혈청
Dulbecco의 Eagle's (DMEM)	Mediatech cellgro	MT10013CVRF	NIH 3T3 배지
페니실린-스트렙토마이신	Mediatech		MT30004CIRF NIH 3T3 중간 보충제
이머젼 오일 타입 LDF 비형광	Nikon	77007	이머젼 오일, 오브젝티브 렌즈용