Ikke-destruktiv kontrol af nedbrydeligt stillads-baserede Tissue Engineering blodkar udvikling ved hjælp af optisk kohærens tomografi
Summary
En trin for trin protokol for ikke-destruktiv og længe-periode overvågning proces af vaskulære remodellering og stillads nedbrydning i real-time kultur af bionedbrydeligt polymere stillads-baserede tissue Engineering blodkar med pulsatile stimulation ved hjælp af optisk kohærens tomografi er beskrevet her.
Abstract
Manipuleret vaskulære transplantationerne med konstruktions- og maskinmæssigt egenskaber svarende til naturlige blodkar forventes at imødekomme den stigende efterspørgsel for arterielle bypass. Karakterisering af vækst dynamics og remodeling proces af nedbrydeligt polymer stillads-baserede tissue Engineering blodkar (TEBVs) med pulsatile stimulation er afgørende for karvæv engineering. Optiske billeddannelse teknikker skiller sig ud som kraftfulde værktøjer til at overvåge vascularization manipuleret væv giver høj opløsning imaging i real-time kultur. Dette papir viser en ikke-destruktiv og hurtig real-time imaging strategi for at overvåge væksten og remodellering af TEBVs i langsigtede kultur ved at bruge optisk kohærens tomografi (OCT). Geometriske morfologi evalueres, herunder vaskulære remodeling proces, vægtykkelse og sammenligning af TEBV tykkelse i forskellige kultur tid og tilstedeværelse af pulsatile stimulation. Endelig, i OLT giver praktiske muligheder for real-time overvågning af polymer i voldsomme væv under pulsatile stimulation nedbrydning eller ej og på hvert fartøj segment, af sammenlignet med vurdering af polymer nedbrydning ved hjælp af scanning elektron microscopic(SEM) og polariseret mikroskop.
Introduction
Væv-manipuleret blodkar (TEBVs) er den mest lovende materiale som en ideel vaskulære graft1. For at udvikle grafts for at være klinisk nyttigt med tilsvarende strukturelle og funktionelle egenskaber som hjemmehørende fartøjer, er flere teknikker designet til at opretholde vaskulær funktion2,3. Selvom der har været manipuleret fartøjer med acceptabel passage satser under implantation og i fase III kliniske undersøgelse4, viser langtidskulturer og høje omkostninger også nødvendigheden af at overvåge udviklingen i TEBVs. Forståelse af ekstracellulære matrix(ECM) vækst, ombygning og tilpasning processer i TEBVs i biomimetiske kemo-mekaniske miljø kan give afgørende oplysninger for udviklingen af karvæv engineering.
Den ideelle strategi til at spore udviklingen af lille diameter manipuleret fartøjer5 bør være ikke-slettende, steril, langsgående, tre-dimensionelle og kvantitative. TEBVs forskellige kultur betingelser kunne vurderes af denne imaging modalitet, selv inklusive ændringer før og efter vaskulære transplantation. Strategier til at beskrive funktionerne i levende manipuleret fartøjer er nødvendige. Optiske billeddannelse teknikker giver mulighed for visualisering og kvantificering af væv deposition og biomaterialer. Andre fordele er muligheden for at aktivere dybe væv og etiket-gratis billedbehandling med høj opløsning6,7. Image-specifikke molekyler og mindre lettilgængelige optisk udstyr til real-time overvågning er imidlertid en betydelig praktisk hindring, som har begrænset den omfattende anvendelse af ikke-lineær Optisk mikroskopi. Optisk kohærens tomografi (OCT) er en optisk tilgang med intravaskulær imaging modalitet som et almindeligt anvendt klinisk værktøj til at guide hjerte interventionel terapi8. I litteraturen blev metode i OLT rapporteret som en måde at vurdere vægtykkelse af TEBVs9,10, kombineret med bekræftende billeddiagnostiske modaliteter til karvæv engineering research. Der henviser til, at dynamikken i manipuleret vaskulære blev vækst og remodellering ikke observeret.
I dette manuskript detalje vi forberedelse af biologisk nedbrydeligt polymert stillads-baseret TEBVs for fire uger kultur. Menneskelige umbilical arterier vaskulære glatte muskelceller (HUASMCs) er udvidet og seeded i en porøs nedbrydelige polyglycolic syre (PGA) stilladser i bioreaktor. Biologisk nedbrydelige polymerer spille rollen i en midlertidig substrat for vævsteknologi og har en vis nedbrydning sats11. For at sikre en passende match mellem stillads nedbrydning og neo-væv dannelse, er ECM og PGA stilladser afgørende faktorer for effektiv vaskulære remodellering. Perfusion system simulerer den biomekaniske mikromiljø af hjemmehørende fartøjer og fastholder en konsekvent deformation under pres stimulation.
Præsenteres protokollen sigter mod at beskrive en relativt enkel og ikke-destruktiv strategi for TEBVs billeddannelse og langsigtet overvågning af kultur. Denne protokol kan anvendes til visualisering af morfologiske ændringer og tykkelsesmålinger manipuleret fartøjer under forskellige kultur betingelser. Derudover kan analyser af polymer-baserede materialer nedbrydning i væv engineering stilladser udføres for identifikation. Ved at kombinere metoder til scanning elektron microscopic(SEM) og polariseret mikroskop bruges i denne protokol, korrelation og kvantificering af ekstracellulære matrix distribution og PGA nedbrydning kan gøres, som kan lette vurderingen af stillads nedbrydning kombineret med OCT billeddannelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
At generere manipuleret fartøjer med struktur og mekaniske egenskaber svarende til native blodkar kan føre til at forkorte tiden til klinisk brug og er det ultimative mål af vaskulære teknik. Optiske billeddannelse teknikker tillade visualisering af væv manipuleret vaskulære specifikke komponenter, som kan overvåge individuelle konstruktioner i hele kultur og eksponering grafts til en kultur miljø uden at kompromittere sterilitet7. I denne artikel, er kultur-salen adskilt fra perfusion sys…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende den videnskab og teknologi planlægger projektet i Guangdong provinsen i Kina (2016B070701007) til støtte for dette arbejde.
Materials
| PGA mesh | Synthecon | ||
| silicone tube | Cole Parmer | ||
| connector | Cole Parmer | ||
| intravascular OCT system | St. Jude Medical, Inc | ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM | |
| scanning electron microscopic | Philips | FEI Philips XL-30 | |
| polarized microscope | Olympus | Olympus BX51 | |
| sutures | Johnson & Johnson | ||
| pulsatile pump | Guangdong Cardiovascular Institute | ||
| LightLab Imaging software | St. Jude Medical, Inc |
References
- Chan-Park, M. B., et al. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).
- Ballyns, J. J., Bonassar, L. J. Image-guided tissue engineering. Journal of Cellular & Molecular Medicine. 13, 1428-1436 (2009).
- Smith, L. E., et al. A comparison of imaging methodologies for 3D tissue engineering. Microscopy Research & Technique. 73, 1123-1133 (2010).
- Chang, W. G., Niklason, L. E. A short discourse on vascular tissue engineering. NPJ Regenerative Medicine. 2, (2017).
- Appel, A. A., Anastasio, M. A., Larson, J. C., Brey, E. M. Imaging challenges in biomaterials and tissue engineering. Biomaterials. 34, 6615-6630 (2013).
- Rice, W. L., et al. Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy. Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).
- Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 3335-3339 (2010).
- Zheng, K., Rupnick, M. A., Liu, B., Brezinski, M. E. Three Dimensional OCT in the Engineering of Tissue Constructs: A Potentially Powerful Tool for Assessing Optimal Scaffold Structure. Open Tissue Engineering & Regenerative Medicine Journal. 2, 8-13 (2009).
- Gurjarpadhye, A. A., et al. Imaging and characterization of bioengineered blood vessels within a bioreactor using free-space and catheter-based OCT. Lasers in Surgery and Medicine. 45, 391-400 (2013).
- Chen, W., et al. In vitro remodeling and structural characterization of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered vascular grafts using optical coherence tomography. Cell & Tissue Research. 370, 417-426 (2017).
- Naito, Y., et al. Characterization of the natural history of extracellular matrix production in tissue-engineered vascular grafts during neovessel formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
- Ye, C., et al. The design conception and realization of pulsatile ventricular assist devices-from Spiral-Vortex pump to Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 9, 35-40 (2002).
- Chen, W., et al. Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).
- Pickering, J. G., Boughner, D. R., et al. Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis. American Journal of Pathology. 138, 1225-1231 (1991).
- Martinho, J. A., et al. Dependence of optical attenuation coefficient and mechanical tension of irradiated human cartilage measured by optical coherence tomography. Cell Tissue Bank. 16, 47-53 (2015).
- Poirierquinot, M., et al. High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold architecture and cell seeding. Tissue Engineering Part C Methods. 16, 185-200 (2010).
- Naito, Y., et al. Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model. Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).
- Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).
