Сохранение биологических культур и измерения экспрессии генов в nerii тля: Non модель системы для взаимодействия растений насекомое
Summary
Nerii Бахчевая тля колонизирует на высоко защищал растений семейства dogbane (Apocyanaceae) и предоставляет многочисленные возможности для изучения взаимодействия растений насекомое. Здесь мы представляем серию протоколов для поддержания растений и тли, культур и поколения и анализ молекулярных и – omic данные для A. nerii.
Abstract
Тли являются отличным экспериментальные модели для различных биологических вопросов, начиная от эволюции симбиозов и развития polyphenisms вопросы вокруг насекомых взаимодействия с их растений-хозяев. Геномных ресурсов доступны для нескольких видов тлей, и с достижениями в области секвенирования следующего поколения, транскриптомики исследования расширяются-модель организмов, которые не имеют геномов. Кроме того тля культур можно собраны из поля и выращены в лабораторных условиях для использования в научные и молекулярных экспериментов, чтобы преодолеть разрыв между экологических и генетических исследований. Наконец многие тля может быть сохранен в лаборатории на их предпочтительным разместить растения в вечный, parthenogenic жизненных циклов, позволяя для сравнения бесполым воспроизведения генотипов. Nerii тля, молочая олеандр тля, обеспечивает одной из таких моделей для изучения насекомых взаимодействия с токсичных растений, используя научные и молекулярных экспериментов. Методы для создания и обслуживания растений и тля культур в парниковых и лаборатории, экстракции ДНК и РНК, анализ микроспутник, de novo транскриптом Ассамблеи и аннотации, транскриптом дифференциального выражение анализ и проверка ПЦР дифференциально выраженной генов изложил и обсуждали здесь.
Introduction
Тли являются небольшие, hemimetabolous насекомых, которые колонизировали на разнообразных растений семей во всем мире. Они являются отличительными для нескольких функций, наиболее особенно сложные жизненные циклы с участием циклический Партеногенез и дискретные polyphenisms и их обязывают питания симбиоз с бактериальной или дрожжи endosymbionts, которые поставляют питательные вещества, пропавших из их диета завод sap1. Хотя большинство тли являются специалистами завода хост, некоторые виды общего профиля являются важными сельскохозяйственными вредителями, нанося значительный экономический ущерб на посевах либо непосредственно или через патогенные микроорганизмы и вирусы они вектор2. Публикация первого тля генома в 2010 году, Гороховая тля Гороховая pisum3, отмечен важной вехой в изучении биологии тля, потому, что она представила геномных ресурсов для решения вопросов о насекомых адаптации к травоядным образа жизни, включая те, которые могут привести к лучшей стратегии управления4. С того времени дополнительные геномных ресурсов накопились с публикацией аннотированный генома glycines Бахчеваятля сои5, и публично доступен весь геном ресурсов для другого вида три тли (Myzus cerasi (Черная вишня тли), Myzus persicae (персик картофеля тли), Rhopalosiphum padi (Черемуха овсяная тля)6. Ценный de novo транскриптомики ресурсы доступны также для целого ряда других видов тли (e.g.,Aphis тля (хлопок тля)7, Sitobion avenae (зерно тля)8, Cinara pinitabulaeformis (сосна тля)9, nerii тля (Милкуид олеандр тля)10).
Тля также сделал прочный вклад в наше понимание взаимодействия растений насекомых и экологии жизни растений11. Одной из областей, где тли внесли особенно важный вклад находится в нашем понимании химической экологии принимающей завод взаимодействий. Растительноядные насекомые Экспресс различных приспособлений для преодоления защиты растений, а некоторые даже кооптировать защиты растений для их собственных пользу12,,1314. Например молочая олеандр тля, nerii тля, является яркий желтый, инвазивные тли в умеренных и тропических регионах во всем мире, который колонизирует на растений молочая семейства (Кутровые). Растения семейства Кутровые развивались различные химической защиты, включая молочный латекс и сердечных гликозидов, известный как cardenolides, которые связывают перевозчик катионов Na, K-АТФазы и эффективного сдерживания универсалом травоядных животных15, 16. специалистов в Милкуид выразить различные режимы сопротивления cardenolides, и некоторые выборочно пассивно накапливать или cardenolides в их тканях как средство сдерживания хищничества или другие преимущества17. A. nerii считается секвестр cardenolides таким образом, хотя механизмы и функциональные преимущества остаются неясными10,18.
Учитывая геномных ресурсов под рукой, а nerii обеспечивает отличную Экспериментальная модель для изучения молекулярных и генетических механизмов, участвующих в химико экологических взаимодействий между токсичных хост растений и их специалист травоядных животных. Стоит отметить, что, хотя некоторые из ранних исследований A. nerii сосредоточена на поглощение cardenolides19, с того времени, исследования а. nerii дали взглянуть на широкий набор эволюционные и экологические вопросы, в том числе генетическую структуру инвазивных насекомых20 и взаимосвязи между снизу вверх и сверху вниз регулирования плотности травоядных21. A. nerii , таким образом, является хорошим кандидатом как экспериментальная модель для особенно широкий спектр исследований насекомых завод взаимодействий. Решающее значение для успеха любого исследования с а. nerii является тщательное культура тля населения, которое включает в себя культуру растений, от которых зависят тли, а также эффективного поколения высокого качества – omic данных. Наша цель – направлять читателя через оба. Ниже перечислены методы для создания и поддержания культур растений и тли в парниковых и лаборатории, ДНК и РНК извлечений, микроспутник анализа, de novo транскриптом Ассамблеи и аннотации, транскриптом анализ дифференциального выражения и ПЦР проверка дифференциально выразил генов. Хотя эти методы пишутся для A. nerii, общие методы культивирования, извлечения и анализа может распространяться на различных видов тлей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Давно признано, что aposematic A. nerii может обеспечить понимание структуры и механизмы сопротивления к заводе оборону и особенно химического связывания18,37. A. nerii10, предлагая новые возможности для экологического и функциональных геномных…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Мишель Луна (Университет Вандербильта) за помощь с фотографией. Университет Вандербильта условии ПА и SSLB поддерживаются DGE-1445197.
Materials
| Sun Gro Fafard Germination Mix | Hummert International | 10-0952-2 | |
| Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix | Hummert International | 10-0951-2 | |
| 2x 4" Round Standard Pot | Anderson Pots | 1503 | |
| DreamTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0701 | |
| Trizol | ThermoFisher Scientific | 15596026 | |
| SuperScript® III First-Strand Synthesis kit | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4367659 |
References
- Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
- Dixon, A. F. G. . Aphid Ecology: An Optimization Approach. , (1985).
- Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313 (2010).
- Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
- Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
- Li, Z. -. Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180 (2013).
- Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
- Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
- Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
- Dixon, A. F. G. . Insect Herbivore-Host Dynamics. , (2005).
- Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
- Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
- Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
- Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
- Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect’s perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
- Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
- Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems – a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
- Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
- Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid ‘superclone’: extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524 (2011).
- Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
- Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
- Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
- Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, 279-285 (2016).
- The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
- Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
- Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31 (2014).
- Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
- Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
- Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
- Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
- Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417 (2010).
