हॉटस्पॉट क्षेत्रों में उत्परिवर्तनों का व्यापक और एक साथ पता लगाने के लिए एकल छोटी बूंद डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान एक ही प्रतिक्रिया में एक लक्ष्य क्षेत्र के कई आनुवंशिक परिवर्तन ddPCR और hydrolysis जांच का एक अनूठा जोड़ी का उपयोग कर मात्रा को बढ़ाता है ।
Abstract
छोटी बूंद डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (ddPCR) नैनो आकार के पानी में तेल व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं के हजारों में नमूना अंश पर आधारित एक अति संवेदनशील मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) विधि है । हाल ही में, ddPCR ट्यूमर डीएनए (ctDNA) का पता लगाने के लिए परिसंचारी के लिए सबसे सटीक और संवेदनशील उपकरणों में से एक बन गया है । मानक ddPCR तकनीक की प्रमुख सीमाओं में से एक उत्परिवर्तनों की सीमित संख्या है कि प्रतिक्रिया प्रति दिखलाई जा सकता है, के रूप में विशिष्ट hydrolysis प्रत्येक संभव allelic संस्करण को पहचानने की जांच की आवश्यकता है । एक वैकल्पिक पद्धति, ड्रॉप बंद ddPCR, प्रवाह बढ़ जाती है, क्योंकि यह जांच की केवल एक जोड़ी की आवश्यकता का पता लगाने और लक्षित क्षेत्र में संभावित सभी आनुवंशिक परिवर्तन यों तो । ड्रॉप बंद ddPCR एक ही प्रतिक्रिया में उत्परिवर्तनों की एक बड़ी संख्या का पता लगाने के लाभ के साथ पारंपरिक ddPCR परख के लिए तुलनीय संवेदनशीलता प्रदर्शित करता है । यह लागत प्रभावी है, कीमती नमूना सामग्री को संरक्षित करता है, और यह भी एक खोज उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जब उत्परिवर्तनों एक प्राथमिकताओंज्ञात नहीं हैं ।
Introduction
शारीरिक कैंसर के विकास से संबंधित उत्परिवर्तनों के हजारों1बताया गया है । इन के अलावा, कुछ लक्षित चिकित्सा 2,3 और इन उत्परिवर्तनों के आनुवंशिक स्क्रीनिंग की प्रभावकारिता के पूर्वानुमान मार्करों है अब नियमित नैदानिक अभ्यास है । छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (ddPCR) प्रौद्योगिकी उपस्थिति या उच्च का पता लगाने सटीकता के साथ उत्परिवर्तनों के अभाव के लिए निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और गैर इनवेसिव तरल बायोप्सी4,5के साथ अत्यधिक संगत है । हालांकि, वर्तमान ddPCR परख मुख्य रूप से एक प्राथमिकताओंज्ञात उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । यह गंभीर रूप से एक खोज उपकरण के रूप में ddPCR का उपयोग सीमा जब उत्परिवर्तन अज्ञात है । दरअसल, पारंपरिक ddPCR डिजाइन में, एक hydrolysis जंगली प्रकार एलील (WT जांच) को पहचानने जांच उत्परिवर्ती एलील (MUT जांच) (आंकड़ा 1a) पहचानने एक विशिष्ट जांच के साथ प्रतिस्पर्धा है । उच्च संबध के साथ जांच टेंपलेट के लिए hybridizes और उसके fluorophore विज्ञप्ति, इसी एलील की प्रकृति का संकेत है । प्रत्येक छोटी बूंद के लिए प्राप्त प्रतिदीप्ति डेटा एक तितर बितर साजिश में visualized किया जा सकता है WT और MUT जांच विभिंन आयामों में उत्सर्जित प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व । एक पारंपरिक ddPCR परख के लिए एक ठेठ परिणाम के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्र 1aमें प्रस्तुत किया है । इस उदाहरण में, नीले बादल WT जांच द्वारा पहचाने गए WT alleles युक्त बूंदों से मेल खाती है, जबकि लाल बादल उन बूंदों से मेल खाती है जिनमें MUT एलील को MUT जांच द्वारा प्रवर्धित और पहचाना गया है । प्रतिक्रिया में लोड डीएनए की मात्रा के आधार पर, WT और MUT दोनों amplicons युक्त दोहरी सकारात्मक बूंदों (हरे बादल) प्रकट कर सकते हैं । हल्की धूसर बादल खाली बूंदों से मेल खाती है ।
के बाद से सबसे प्लेटफार्मों fluorophores की एक सीमित संख्या का पता लगाने के लिए अनुमति (आमतौर पर 2, लेकिन अप करने के लिए 5), पारंपरिक ddPCR का प्रवाह सीमित है । इसलिए, कई आसंन उत्परिवर्तनों के साथ क्षेत्रों लक्ष्यीकरण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण मल्टीप्लेक्स ddPCR परख या एकाधिक समानांतर में प्रत्येक उत्परिवर्तन लक्ष्यीकरण प्रतिक्रियाओं के उपयोग के डिजाइन की आवश्यकता है । ड्रॉप बंद ddPCR रणनीति, इस सीमा पर काबू के रूप में यह संभवतः एक लक्षित क्षेत्र के भीतर किसी भी आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाने के WT hydrolysis जांच की एक अनूठी जोड़ी का उपयोग कर सकते हैं । पहली जांच (जांच 1) एक गैर चर अनुक्रम, लक्ष्य क्षेत्र और दूसरी जांच (जांच 2) को कवर लक्ष्य क्षेत्र के WT अनुक्रम जहां उत्परिवर्तनों (आंकड़ा 1b) की उंमीद कर रहे है के पूरक है । जबकि पहली जांच प्रतिक्रिया में प्रवर्धित अणुओं की कुल राशि quantifies, दूसरी जांच भेदभाव WT और MUT alleles उप द्वारा इष्टतम संकरण के उत्परिवर्ती दृश्यों के लिए । जांच 2 लक्ष्य क्षेत्र में उत्परिवर्तनों के कई प्रकार की पहचान कर सकते है (एक या एकाधिक न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन, विलोपन, आदि)6। पारंपरिक ddPCR में के रूप में, प्रकाश ग्रे बादल कोई डीएनए अणुओं युक्त बूंदों से मेल खाती है । यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि परख के इस प्रकार, WT और MUT बादलों की इष्टतम जुदाई में प्रतिक्रिया में भरी हुई डीएनए की मात्रा पर निर्भर है, के बाद से दोनों WT और MUT लक्ष्य alleles युक्त बूंदों केवल WT युक्त बूंदों से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है प्रपत्र. इसलिए, इस परख की आवश्यकता है कि अधिकांश बूंदों को लक्षित जीन की एक से अधिक प्रति नहीं होते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक कुशल ड्रॉप बंद ddPCR परख डिजाइन, अनुकूलन महत्वपूर्ण है, और प्रोटोकॉल ध्यान से पालन किया जाना चाहिए । प्राइमरों और जांच के प्रत्येक संयोजन एक अद्वितीय पीसीआर प्रतिक्रिया दक्षता है । इस प्रकार, एक व्यक्त…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य में Institut क्यूरी सिर्क (ग्रांट इंका-DGOS-४६५४) का सहयोग लिया गया । लेखक भी चाहते है कि वीडियो के लिए उसके योगदान के लिए कैरोलीन Hego धंयवाद ।
Materials
| K2EDTA tube (color code : lavender) | BD | 367863 | EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) | Qiagen | 55114 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) | Qiagen | 937556 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony SP system | Qiagen | 9001297 | fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA |
| QX100 or QX200 reader | Bio-Rad | 186-3003 or186-4003, respectively | The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector |
| QX100 or QX200 droplet generator | Bio-Rad | 186-3002 or 186-4002, respectively | Instrument used for droplet generation |
| C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851196 | Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module |
| Plate sealer | Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ PCR plate sealer |
| DG8 cartridge holder | Bio-Rad | 186-3051 | Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation |
| Droplet generator cartridges and gaskets | Bio-Rad | 186-4007 | Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation |
| PCR supermix | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR supermix for probes (no dUTP) |
| 96-well PCR plates | Eppendorf | 951020362 | 96-well semi-skirted plates |
| Foil seal | Bio-Rad | 181-4040 | Pierceable foil heat seal |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 186-3004 | oil used in the read |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 186-3005 | oil for droplet generation |
| DNA loBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding |
| Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations |
| QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer |
References
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