Eneste dråpe digitale polymerasekjedereaksjons omfattende og samtidige deteksjon av mutasjoner i Hotspot regioner
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å nøyaktig kvantifisere flere genetiske endringer av målet regionen i en enkelt reaksjon drop-off ddPCR og en unik par hydrolyse sonder.
Abstract
Slippverktøy digital polymerasekjedereaksjons (ddPCR) er en høylig følsom kvantitative polymerase kjedereaksjon (PCR) metode basert på prøve fraksjoneres til tusenvis av nano-størrelse vann-i-olje personlige reaksjoner. Nylig har ddPCR blitt en av de mest nøyaktige og følsom verktøyene for sirkulerende svulst DNA (ctDNA) oppdagelsen. En av de store begrensningene av standard ddPCR teknikken er begrenset antall mutasjoner som kan bli vist per reaksjon, som bestemt hydrolyse sonder anerkjenne hver mulig allel versjon kreves. En alternativ metode, drop-off-ddPCR øker gjennomstrømning, siden det krever bare et enkelt par sonder for å oppdage og kvantifisere potensielt alle genetiske endringer i regionen målrettet. Drop-off ddPCR viser sammenlignbare følsomhet til konvensjonelle ddPCR analyser med fordelen av å oppdage flere mutasjoner i en enkelt reaksjon. Det er kostnadseffektivt, sparer dyrebare utvalget materialet og kan også brukes som et funn verktøy når mutasjoner ikke er kjent en priori.
Introduction
Tusenvis av somatiske mutasjoner knyttet til hudkreft har vært rapportert1. Blant disse, noen er prediktiv markører av effekten av målrettet terapi 2,3 og genetiske screening av disse mutasjoner er nå rutinemessige klinisk praksis. Slippverktøy digital PCR (ddPCR) teknologien kan brukes til å overvåke for tilstedeværelse eller fravær av mutasjoner med høy oppdagelsen nøyaktighet og er høyst kompatibel med ikke-invasiv flytende biopsier4,5. Imidlertid er gjeldende ddPCR analyser hovedsakelig laget for å oppdage mutasjoner kjent en priori. Dette begrenser sterkt bruk av ddPCR som et funn verktøy når mutasjon er ukjent. Faktisk i tradisjonell ddPCR design konkurrerer en hydrolyse sonde erkjenner det vill-type allelet (WT sonde) med en bestemt sonde erkjenner det muterte allelet (MUT sonde) (figur 1A). Sonde med høyere affinitet arten i malen og utgivelser sin fluorophore, som indikerer det tilsvarende allelet. Fluorescens dataene innhentet for hver dråpe kan visualiseres i et spredningsdiagram som representerer fluorescens slippes ut av WT og MUT sonder i ulike dimensjoner. En skjematisk fremstilling av en typisk resultat for en konvensjonell ddPCR analysen er presentert i figur 1A. I dette eksemplet tilsvarer blå skyen dråpestørrelse inneholder WT alleler identifisert av WT proben, mens røde skyen tilsvarer dråper der MUT allelet har blitt forsterket og identifisert av MUT sonden. Avhengig av antall DNA i reaksjonen, kan dobbel positiv dråpestørrelse inneholder både WT og MUT amplicons vises (grønn Sky). Lys grå skyen tilsvarer tom dråper.
Siden de fleste plattformer tillater påvisning av et begrenset antall fluorophores (vanligvis 2, bortsett fra til 5), er gjennomstrømningen av konvensjonelle ddPCR begrenset. Derfor krever målretting med flere tilstøtende mutasjoner utformingen av teknisk utfordrende multiplex ddPCR analyser eller bruk av flere reaksjoner målretting hver mutasjon parallelt. Drop-off ddPCR strategi, seirer denne begrensningen som det kan potensielt oppdage eventuelle genetiske endringer innenfor et mål område med en unik WT hydrolyse sonder. Første sonde (sonde 1) dekker en ikke-variabel sekvens, målregion og andre sonden (sonde 2) er utfyllende til WT sekvensen av målregion der mutasjoner er forventet (figur 1B). Mens den første romsonden kvantifiserer totalbeløpet for amplifiable molekyler i reaksjonen, diskriminerer andre proben WT og MUT alleler av sub-optimale hybridisering i mutant sekvenser. Sonden 2 kan identifisere flere typer mutasjoner i målet regionen (ett eller flere nukleotid erstatninger, sletting, etc.)6. Som vanlig ddPCR tilsvarer lys grå skyen dråpestørrelse inneholder ingen DNA molekyler. Det er viktig å huske at i denne analysen, optimal separasjon av WT og MUT skyer er avhengig av antallet DNA lastet i reaksjonen, siden dråpestørrelse inneholder både WT og MUT målet alleler ikke kan skilles fra dråpestørrelse inneholder bare WT skjemaet. Derfor krever denne analysen at de fleste dråpestørrelse inneholder mer enn én kopi av målrettet genet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hvis du vil utforme en effektiv drop-off ddPCR analysen, optimalisering er avgjørende, og protokollen må følges nøye. Hver kombinasjon av primere og sonder har en unik PCR reaksjon effektivitet. Dermed har individuelle analysen godkjennes nøye på kontroll prøver før den brukes på verdifulle test prøver. Optimalisering og godkjenningen er viktig å sertifisere peak signalgjenkjenning og vurdere spesifisitet og følsomhet. Som beskrevet i protokollen, kan alle mutasjoner i et mål område dekket av “sonden 2” pot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). Forfatterne vil også takke Caroline Hego for hennes bidrag til video.
Materials
| K2EDTA tube (color code : lavender) | BD | 367863 | EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) | Qiagen | 55114 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) | Qiagen | 937556 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony SP system | Qiagen | 9001297 | fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA |
| QX100 or QX200 reader | Bio-Rad | 186-3003 or186-4003, respectively | The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector |
| QX100 or QX200 droplet generator | Bio-Rad | 186-3002 or 186-4002, respectively | Instrument used for droplet generation |
| C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851196 | Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module |
| Plate sealer | Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ PCR plate sealer |
| DG8 cartridge holder | Bio-Rad | 186-3051 | Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation |
| Droplet generator cartridges and gaskets | Bio-Rad | 186-4007 | Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation |
| PCR supermix | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR supermix for probes (no dUTP) |
| 96-well PCR plates | Eppendorf | 951020362 | 96-well semi-skirted plates |
| Foil seal | Bio-Rad | 181-4040 | Pierceable foil heat seal |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 186-3004 | oil used in the read |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 186-3005 | oil for droplet generation |
| DNA loBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding |
| Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations |
| QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer |
References
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).
- Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).
- Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).
- Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).
- Decraene, C., Silveira, A. B., et al. Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR. Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).
- Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).
- Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).
- Bidshahri, R., Attali, D., et al. Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).
- Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data. F1000Research. 5, (2016).
- Forbes, S. A., Beare, D., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).
