Enda Droplet Digital polymeraskedjereaktion för omfattande och samtidiga detektion av mutationer i Hotspot områden
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att exakt kvantifiera flera genetiska förändringar av en målregionen i en enda reaktion som använder drop-off ddPCR och ett unikt par hydrolys sonder.
Abstract
Droplet digital polymeraskedjereaktion (ddPCR) är en mycket känsliga kvantitativa polymeras-kedjereaktion (PCR) metod baserad på prov fraktionering in tusentals av nano-storlek vatten-i-olja individuella reaktioner. Tid har blivit ddPCR en av de mest exakta och känsliga verktyg för cirkulerande tumör DNA (ctDNA) upptäckt. En av de stora begränsningarna av standard ddPCR tekniken är det begränsa antalet mutationer som kan kontrolleras per reaktion, som särskilda hydrolys sonder erkänner varje möjligt alleliska version krävs. En alternativ metod, den drop-off ddPCR, ökar genomströmningen, eftersom det kräver bara ett enda par sonder för att påvisa och kvantifiera potentiellt alla genetiska förändringar i den berörda regionen. Drop-off ddPCR visar jämförbara känslighet till konventionella ddPCR analyser med fördelen av att upptäcka ett större antal mutationer i en enda reaktion. Den är kostnadseffektiv, sparar dyrbar provmaterial och kan också användas som ett upptäckt verktyg när mutationer inte är kända förhand.
Introduction
Tusentals somatiska mutationer relaterade till cancerutveckling har varit rapporterade1. Bland dessa, några är prediktiva markörer av effekten av riktad terapi 2,3 och genetisk screening av dessa mutationer är nu rutinmässig klinisk praxis. Droplet digital PCR (ddPCR) teknik kan användas för att övervaka förekomsten eller avsaknaden av mutationer med hög upptäckten exakthet och är kompatibel med icke-invasiv flytande biopsier4,5. Nuvarande ddPCR analyser är dock primärt utformade för att upptäcka mutationer kända förhand. Detta begränsar allvarligt användningen av ddPCR som ett upptäckt verktyg när mutationen är okänd. Faktiskt, i de konventionella ddPCR designen, en hydrolys sond erkänner den vildtyps-allelen (WT Probe) konkurrerar med en specifik sond som erkänner den muterade allelen (MUT Probe) (figur 1A). Sonden med högre affinitet hybridizes till mallen och frigör dess fluorophore, som anger arten av den motsvarande allelen. Fluorescens uppgifterna om varje droppe kan visualiseras i ett spridningsdiagram representerar fluorescensen som avges av de WT och MUT sonderna i olika dimensioner. En schematisk representation av ett typiskt resultat för en konventionell ddPCR analys presenteras i figur 1A. I det här exemplet motsvarar blå molnet droppar som innehåller WT alleler identifieras av WT sonden, medan röda molnet motsvarar droppar där den MUT-allelen har förstärkt och identifierats av MUT sonden. Beroende på mängden DNA laddad i reaktionen, kan dubbel positiv droppar som innehåller både WT och MUT amplikoner visas (gröna moln). Ljus grå molnet motsvarar tom droppar.
Eftersom de flesta plattformar möjliggör upptäckt av ett begränsat antal fluorophores (vanligtvis 2, men upp till 5), är genomströmning av konventionella ddPCR begränsad. Inriktning regioner med flera intilliggande mutationer kräver därför utformningen av tekniskt utmanande multiplex ddPCR analyser eller användning av flera reaktioner inriktning varje mutation parallellt. Drop-off ddPCR strategin, övervinner denna begränsning som det potentiellt kan upptäcka någon genetisk förändring inom ett mål med hjälp av ett unikt par WT hydrolys sonder. Den första sond (Probe 1) omfattar en icke-variabel sekvens, intill målregionen och andra sonden (sond 2) är ett komplement till WT sekvensen av målregionen där mutationer är förväntat (figur 1B). Medan den första sonden kvantifierar den totala mängden amplifiable molekyler i reaktionen, diskriminerar andra sonden WT och MUT alleler av suboptimal hybridisering till mutant sekvenser. Sond 2 kan identifiera flera typer av mutationer i mål regionen (enstaka eller flera nukleotid substitutioner, radering, etc.)6. Som i konventionella ddPCR motsvarar ljus grå molnet droppar som innehåller inget DNA-molekyler. Det är viktigt att komma ihåg att i denna typ av analys, optimal separation av WT och MUT moln är beroende av mängden DNA laddas i reaktionen, eftersom droppar som innehåller både WT och MUT mål alleler inte kan särskiljas från droppar som innehåller endast WT formuläret. Denna analys kräver därför att de flesta droppar innehåller inte mer än en kopia av genen riktade.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att designa en effektiv drop-off ddPCR analys, optimering är avgörande, och protokollet måste följas noggrant. Varje kombination av primers och sonder har en unik PCR-reaktion effektivitet. Således har en individuell analys valideras noggrant på kontrollprover innan de används på värdefulla provföremål. Optimering och validering är viktigt att certifiera peak signaldetektion och bedöma specificitet och känslighet. Som beskrivs i protokollet, kan alla mutationer i ett målregionen omfattas av ”sonden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). Författarna vill även tacka Caroline Hego för hennes bidrag till videon.
Materials
| K2EDTA tube (color code : lavender) | BD | 367863 | EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) | Qiagen | 55114 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) | Qiagen | 937556 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony SP system | Qiagen | 9001297 | fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA |
| QX100 or QX200 reader | Bio-Rad | 186-3003 or186-4003, respectively | The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector |
| QX100 or QX200 droplet generator | Bio-Rad | 186-3002 or 186-4002, respectively | Instrument used for droplet generation |
| C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851196 | Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module |
| Plate sealer | Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ PCR plate sealer |
| DG8 cartridge holder | Bio-Rad | 186-3051 | Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation |
| Droplet generator cartridges and gaskets | Bio-Rad | 186-4007 | Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation |
| PCR supermix | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR supermix for probes (no dUTP) |
| 96-well PCR plates | Eppendorf | 951020362 | 96-well semi-skirted plates |
| Foil seal | Bio-Rad | 181-4040 | Pierceable foil heat seal |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 186-3004 | oil used in the read |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 186-3005 | oil for droplet generation |
| DNA loBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding |
| Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations |
| QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer |
References
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).
- Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).
- Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).
- Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).
- Decraene, C., Silveira, A. B., et al. Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR. Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).
- Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).
- Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).
- Bidshahri, R., Attali, D., et al. Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).
- Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data. F1000Research. 5, (2016).
- Forbes, S. A., Beare, D., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).
