Summary

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Published: September 25, 2018
doi:

Summary

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Abstract

Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR) örnek ayırma yağı su bireysel tepkiler nano ölçekli binlerce içine temel bir son derece hassas nicel polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemidir. Son zamanlarda, ddPCR tümör DNA (ctDNA) algılama dolaşan için en doğru ve hassas araçlarından biri haline gelmiştir. Her olası allelic sürüm tanıma belirli hidroliz probları gerektiğinden bir standart ddPCR tekniği önemli sınırlamaları tepki ekranlı mutasyonlar kısıtlı sayısıdır. Probları algılamak ve potansiyel olarak tüm genetik değişiklikler hedeflenen bölgede ölçmek için yalnızca tek bir çift gerektirdiğinden alternatif bir metodoloji, teslim ddPCR, üretilen iş, artırır. Teslimat ddPCR geleneksel ddPCR deneyleri mutasyonlar daha fazla sayıda tek bir reaksiyonu tespit avantajı ile karşılaştırılabilir duyarlılık görüntüler. Düşük maliyetli, değerli örnek malzeme tasarrufu ve mutasyonlar bir prioribilinen değil aynı zamanda bir keşif aracı olarak kullanılabilir.

Introduction

Somatik mutasyon kanser geliştirilmesi için ilgili binlerce bildirilen1olmuştur. Bunlar arasında birkaç akıllı işaretleri etkinliğinin hedefe yönelik tedavi 2,3 ve şimdi rutin klinik pratikte bu mutasyonlar eleme genetik. Damlacık dijital PCR (ddPCR) teknoloji olup mutasyonların yüksek algılama hassasiyeti ile izlemek için kullanılan ve non-invaziv sıvı biyopsi4,5ile son derece uyumludur. Ancak, geçerli ddPCR deneyleri öncelikle bir prioribilinen mutasyonlar algılamak için tasarlanmıştır. Mutasyon bilinmeyen olduğunda bu ciddi bir şekilde ddPCR bir keşif aracı olarak kısıtlar. Nitekim, geleneksel ddPCR tasarımında, vahşi tipi gen (WT sonda) tanıma bir hidroliz sonda mutant gen (MUT sonda) (Şekil 1A) tanıma belirli bir sonda ile buz dansında yarışmaktadır. Sonda daha yüksek benzeşimli şablona hybridizes ve karşılık gelen alleli niteliği gösteren onun fluorophore serbest bırakır. Her damla için elde edilen floresan veriler farklı boyutta WT ve MUT probları tarafından yayılan floresans temsil eden bir dağılım çizim olarak görüntülenmeyecektir. Geleneksel ddPCR tahlil için tipik bir sonuç şematik gösterimi Şekil 1Aile sunulur. Örneğin, mavi bulut ise kırmızı bulut içinde MUT alleli edilmiş amplifikatör ve MUT sondası tarafından tanımlanan damlacıkları karşılık gelen WT sondası tarafından tanımlanan WT gen içeren damlacıklar karşılık gelir. Tepki olarak yüklenen DNA miktarı bağlı olarak, Çift Kişilik olumlu damlacıkları WT ve MUT amplicons içeren (yeşil bulut) görünebilir. Işık gri bulut için boş damlacıkları karşılık gelir.

Fluorophores (genellikle 2, 5’e kadar ama) sınırlı sayıda tespiti için en platformlar izin beri geleneksel ddPCR-den geçerek sınırlıdır. Bu nedenle, birden çok bitişik mutasyonlar bölgeleriyle hedefleme Teknik olarak çok katmanlı ddPCR deneyleri veya birden çok tepkiler her mutasyon paralel hedefleme kullanımı zor tasarım gerektirir. Teslimat ddPCR strateji gibi potansiyel olarak WT hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak bir hedef bölge içinde herhangi bir genetik değişiklik tespit edebilen bu sınırlamanın üstesinden gelir. Hedef bölge ve ikinci sonda (sonda 2) bitişik olmayan değişken sıra mutasyonlar nerede hedef bölge WT dizisi tamamlayıcı ilk sonda (sonda 1) kapsar (Şekil 1B) bekleniyor. İlk sonda tepki amplifiable molekülleri toplam miktarı quantifies iken, ikinci sonda WT ve MUT allelleri mutant sıralarını alt-optimal hibridizasyon tarafından ayrımcılık. Sonda 2 hedef bölge (tek veya birden fazla nükleotit oyuncu değişikliği, silme vb.)6‘ mutasyonların birden çok türü tanımlayabilirsiniz. Geleneksel ddPCR olduğu gibi hafif gri bulut yok DNA molekülleri içeren damlacıklar karşılık gelir. Bu tür tahlil, en uygun WT ve MUT bulutlar ayrılması WT ve MUT hedef gen içeren damlacıklar sadece WT içeren damlacıklar ayırt edemez beri tepki olarak yüklenen DNA miktarına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir formu. Bu nedenle, bu tahlil çoğu damlacıkları hedeflenen gen birden fazla kopyasını içermesini gerektirir.

Protocol

Burada sunulan Protokolü Institut Curie etik kuralları izler. Tüm insan örnekleri kaydoldu Institut Curie, Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylanmış çalışmalarda aydınlatılmış onam sonra hastalardan elde edilmiştir. 1. kan toplama, plazma depolama ve boş hücre DNA ekstraksiyon Not: herhangi bir “doku” türünden çıkarılan DNA kullanılabilir (Örneğin, taze veya formaldehit sabit parafin (FFPE) doku, hücre kültürü veya ka…

Representative Results

Bir kanıtı-of-concept çalışmada, KRAS exon 2 mutasyonlar (kodon 12 ve 13) ve EGFR exon 19 silme FFPE doku ve teslimat ddPCR strateji6kullanarak kanserli hastalarda plazma örnekleri incelenmiş. KRAS teslimat sonda hangi insan kanser11bilinen KRAS mutasyonların % 95’den fazla liman birden çok mutasyonların exon 2 KRAS gen kapsaya…

Discussion

Bir verimli teslimat ddPCR tahlil tasarlamak için optimizasyon çok önemli ve protokol dikkatle izlenmesi gerekir. Astar ve sondalar her birleşimi bir benzersiz PCR reaksiyon verimlilik vardır. Böylece, bir tek tek tahlil dikkatli bir şekilde kontrol örnekleri üzerinde değerli test örnekleri üzerinde kullanılmadan önce doğrulanması gerekiyor. En iyi duruma getirme ve doğrulama en yüksek sinyal algılama tasdik ve özgüllük ve duyarlılık değerlendirmek önemlidir. İletişim kuralında açıklandığ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Institut Curie SiRIC (grant Inca-DGOS-4654) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Caroline Hego video onun katkılardan ötürü teşekkür etmek istiyorum.

Materials

K2EDTA tube (color code : lavender) BD 367863 EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) Qiagen 55114 For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) Qiagen 937556 For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system Qiagen 9001297 fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus Qiagen 19413 For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer Invitrogen Q33226 The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader Bio-Rad 186-3003 or186-4003, respectively The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator Bio-Rad 186-3002 or 186-4002, respectively Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler Bio-Rad 1851196 Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer Bio-Rad 181-4000 PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder Bio-Rad 186-3051 Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets Bio-Rad 186-4007 Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix Bio-Rad 186-3010 ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates Eppendorf 951020362 96-well semi-skirted plates
Foil seal Bio-Rad 181-4040 Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 186-3004 oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 186-3005 oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL Eppendorf 0030 108.051 Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set HORIZON HD780 The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 Life Technologies Q32854 The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer

References

  1. Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
  2. Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).
  3. Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).
  4. Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).
  5. Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).
  6. Decraene, C., Silveira, A. B., et al. Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR. Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).
  7. Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).
  8. Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).
  9. Bidshahri, R., Attali, D., et al. Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).
  10. Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data. F1000Research. 5, (2016).
  11. Forbes, S. A., Beare, D., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).

Play Video

Cite This Article
Decraene, C., Bortolini Silveira, A., Michel, M., Bidard, F., Pierga, J., Stern, M., Proudhon, C. Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions. J. Vis. Exp. (139), e58051, doi:10.3791/58051 (2018).

View Video