ウサギモデルにおける最適胚期における低侵襲胚移植と胚ガラス化
Summary
補助生殖技術 (ARTs) は、結果を改善し、関連するリスクを軽減するために継続的に評価されています。本稿では、ヒト生殖の理想的な動物モデルとしてのウサギの使用を可能にする効率的な凍結保存プロトコルを用いた低侵襲胚移植手順について述べる。
Abstract
胚培養または胚凍結保存などの補助生殖技術は、周産期および出生後の結果によって自然発症パターンに影響を及ぼす。アートアプリケーションの安全性を確実にするためには、動物モデルに関する研究が必要である。さらに、胚発生研究では、最後の段階として、健常な子孫を育てる能力を評価する必要があります。ここで、子宮への胚の移植は、あらゆる芸術関連実験を行うために不可欠である。
ウサギは、1世紀以上にわたって哺乳類の生殖を研究するモデル生物として使用されてきた。人間の種とその小さなサイズと低い維持費への系統の近接に加えて、誘発された排卵、ヒトに類似した初期の胚発生の年表、短い妊娠のような重要な生殖特性を有するそれは私たちが簡単に芸術のアプリケーションの結果を研究することができます。さらに、芸術 (細胞質内精子注入、胚培養、または凍結保存など) は、この種で適切な効率で適用される。
この記事で提示された腹腔鏡胚移植技術と凍結保存プロトコルを使用して、1) 簡単に、最小限に侵略的な技術を通して胚を移す方法および 2) ウサギの長期保存のための効果的なプロトコール時間の柔軟な物流能力とサンプルを輸送する能力を提供する胚。異なる発達段階でウサギの胚を移した後に得られた結果は、桑実胚がウサギの胚の回復および伝達にとって理想的な段階であることを示している。したがって、oviductal 胚移植が必要であり、外科的処置を正当化する。さらに、ウサギ morulae は、正常にガラス化および laparoscopically 転写され、記載した技術の有効性を証明する。
Introduction
ヒトの不妊症を迂回すること、または遺伝価値の高い家畜の繁殖を改善し、動物の遺伝資源を保全することを目的として、superovulation のような補助生殖技術と総称される一連の技術体外受精、胚培養、または凍結保存、1、2を開発した。現在、卵巣を刺激し、多数の腹腔卵巣卵胞を生成するホルモン治療が与えられています1.これらの卵胞から採取した卵母細胞は、成熟し、受精し、そして、それらが凍結保存されるか、または代理母3に移されるまで、インビトロで発達させることができる。しかし、これらの治療の間、配偶子および zygotes は、これらの条件4、5で生き残るために胚の適応を必要とする可能性のある一連の非生理的プロセスに暴露される。この適応は、初期胚の可塑性によって可能であり、これは胚の遺伝子発現および発達的プログラミング6の変化を可能にする。しかし、これらの修飾は成人するまでの胚発生のその後の段階に影響を及ぼし、現在広く受け入れられている方法、タイミング、凍結保存手順または培養条件は、胚の運命7に異なる結果を示す,8.したがって、芸術の具体的な誘発効果を解明するためには、よく特徴付けられた動物モデルの使用は不可避である。
哺乳動物胚の移動によってもたらされる最初の記録された生年月日は 18909において起こった。今日、サロゲートメスへの胚移入 (ET) は、その後の胚発達段階10での着床前中の芸術誘発効果を研究する上で極めて重要なステップである。ET の技法は、各動物のサイズおよび解剖学的構造に依存する。大型動物モデルの場合、あおむけ非外科的 ET 法によって ET を行うことが可能であったが、より小型の種では子宮頸部のカテーテル法がより複雑であり、外科的な技術が頻繁に使用されている11.しかし、外科的 ET は、血液が子宮内腔に浸潤して、移植および胚発生を損なう可能性のある出血を引き起こし、胚死10を引き起こす可能性がある。あおむけ非外科的 ET の技術は、依然としてヒト、ヒヒ、ウシ、ブタおよびマウス12、13、14、15、16、17において適用されるが、外科ETs は依然としてヤギ、ヒツジ、またはウサギなどの追加の困難10、18、19、20、21を提示する他の動物などの種で使用されている (2独立 cervices) またはマウス (小サイズ)。それにもかかわらず、外科的伝達方法は、より少ない侵襲的方法で徐々に置き換えられている傾向がある。内視鏡は、例えばウサギ、ブタおよび小さな反芻動物18、19、20において胚を移送するために用いられた。これらの低侵襲性内視鏡検査法は、ウサギに不可欠であり、いくつかの種20で有益な効果を実証している infundibulum を介して合流に胚を移すために使用することができる。これは、卵管の初期胚段階における胚と母親の間の正しい対話の重要性に基づいている。前述したように、卵管を介した胚遊走の間にウサギで起こる胚リモデリングは、22,23を移植することができる胚を達成するために不可欠である。
ウシのような大型動物モデルは、生化学的および着床前の特徴がヒト種24のものと類似しているため興味深い。しかし、大規模な動物は予備試験で使用するには高価すぎる、とげっ歯類は、実験室の研究25のための理想的なモデル (76% モデル生物がげっ歯類である) と考えられています。それにもかかわらず、ウサギモデルは、ヒトによって示されるいくつかの生殖生物学的プロセスがマウスのものよりもウサギの方が類似しているので、生殖研究においてげっ歯類よりいくつかの利点を提供するヒトおよびウサギは、同様の経時的な胚ゲノム活性化、gastrulation および hemochorial 胎盤構造を提示する。加えて、ウサギを用いて、それらの誘発排卵25による受精および妊娠段階の正確なタイミングを知ることができる。ウサギのライフサイクルは短く、31日で妊娠を完了し、約4-5 ヶ月で思春期に達する。動物は、その従順で非攻撃的な行動のために扱いやすいです、そして、その維持は、より大きな動物の費用に比べて非常に経済的です。さらに、ウサギは2つの独立した cervixes11,25を有する二重子宮を有することを言及することが重要である。これにより、異なる実験群からの胚は同じ動物に、しかし別の子宮の角に移すことができるので、ウサギは優先的な位置に置かれる。これにより、両方の実験効果を比較し、母体因子を結果から減らすことができます。
今日では、非外科的 ET 法はウサギでは使用されていません。あおむけ ET 技術を用いて90年代後半に実施されたいくつかの研究は、外科的方法によって 5.5% 〜 20.0%11、26対 50-65% までの低い送達率をもたらしたが、それらの中でも記載の腹腔鏡検査手順Besenfelder と Brem18.ウサギにおけるこれらの非外科的 ET 法の低い成功率は、あおむけ ET で回避される卵管において必要な胚リモデリングの欠如と一致する。ここでは、モデル生物としてウサギを用いた効果的な低侵襲性腹腔鏡 ET 手順について述べる。この技術は、大型動物およびヒトにおけるさらなる生殖研究のためのモデルを提供する。
ウサギは胚移植のために特に狭い時間枠を有するので、この種での ET は、胚の発生段階とレシピエント27の生理的状態との間で高い程度の同期性を必要とする。場合によっては、胚の発育を遅らせ (体外培養など)、または子宮内膜の受容性を変化させる生殖治療 (superovulation 治療など) の後に、胚と母体子宮との間の同調性はない。このような状況は、結果に悪影響を及ぼします。これらの文脈で応答するために、我々は、実験を一時停止し、組織化し、再開することを可能にする効果的なウサギ桑実胚ガラス化プロトコルを説明する。このプロセスは生殖研究のためにロジスティックに望ましい、私達に胚の長期貯蔵のための容量を与え、輸送を許可する。腹腔鏡処置および凍結保存戦略は、より少ない動物での研究のより良い計画を可能にします.このように、我々の方法論は、衛生的で経済的な優位性を提供し、動物研究の 3R (置換、還元、精製) の概念に準拠し、実験動物の人間の治療を改善するという目標を掲げています。したがって、これらの方法を用いて、ウサギはインビボ生殖アッセイのための理想的なモデル生物を構成する。
Protocol
Representative Results
Discussion
移入された胚9からの最初の文書化した生きた出生例以来、この技術およびウサギ種は生殖研究において決定的になっている。また、操作、生産、凍結保存などを含む胚研究の研究は、最後のステップとして、健康な完全期の子孫を生成する胚容量の評価を必要とします。従って、胚移植技術は13、28に不可欠である。長年に…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、スペインの経済産業省 (AGL2017 ・ 85162) と Generalitat バレンシアナ研究プログラム (PrometeoII 2014/036) の資金によって支えられました。N. Macowan 英語サービスによる英語テキストバージョンの改訂
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 332 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Alvet Escartí | 626 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buserelin Acetate | Sigma Aldrich | B3303 | |
| Clorhexidine digluconate soap | Alvet Escartí | 0265DCCJ500B | |
| Clorhexidine digluconate solution | Alvet Escartí | 0265DCCA500B | |
| CO2 | Air Liquide | 99921 | CO2 N48. |
| CO2 Incubator | Fisher scientific | 15385194 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | W387509 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D5773 | Without calcium chloride. |
| Electric razor | Oster Golden A5 | 078005-140-002 | |
| Endoscope camera | Optomic Spain S.A | OP-714 | |
| Endoscope trocar with silicone leaflet valve | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 30114GK | Lightweight trocar model. |
| Enrofloxacin | Alvet Escartí | 9993046 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Epicraneal needle 23G | Alvet Escartí | 514056353 | Smaller needles can be also used. |
| Epidural catheter | Vygon corporate | 187.10 | |
| Epidural needle | Vygon corporate | 187.10 | |
| Ethylene Glycol | Sigma Aldrich | 102466-M | |
| Eye ointment | Alvet Escartí | 5273 | |
| Ketamine hydrochloride | Alvet Escartí | 184 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Laparoscopy equipment | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 26003 AA | Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel. |
| Light source | Optomic Spain S.A | Fibrolux 250 | |
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | P1505XXX | |
| Mechanical CO2 insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | Endoflator® | |
| Meloxicam | Alvet Escartí | 9993501 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Petri dishes, 35-mm | Sigma Aldrich | CLS430165-500EA | |
| Plastic dressing (Nobecutan) | IBOR medica | 7140028 | |
| Plastic Straw 0.25 mL | IMV – technologies | 6431 | |
| Povidone iodide solution | Alvet Escartí | 02656DPYS500S | |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| Silicone tube for insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 20400040 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16F | There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. |
| Sterile Gloves | Alvet Escartí | 087GL010075 | |
| Sterile gown | Alvet Escartí | 12261501 | |
| Sterile mask | Alvet Escartí | 058B15924B | |
| Straw Plug | IMV – technologies | 6431 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Syringe, 1-mL | Fisher scientific | 11750425 | |
| Syringe, 5-mL | Fisher scientific | 11773313 | |
| Urinary catheter | IMV – technologies | 17722 | |
| Waterbath | RAYPA | BAE-4 | |
| Xylazine | Alvet Escartí | 525225 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Rabbits | Universitat Politècnica de València | Line A | Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used. |
References
- Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 388-402 (2017).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84 (5), 674-680 (2015).
- Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 411-417 (2017).
- Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 403-410 (2017).
- Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
- Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6 (5), 377-383 (2015).
- Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 128-144 (2015).
- Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 103-117 (2015).
- Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
- Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
- Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116 (2), 235-242 (1999).
- Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32 (4), 291-296 (2014).
- Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
- Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101 (3), e13 (2014).
- Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81 (1), 152-169 (2014).
- Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92 (2), 120-123 (2015).
- Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
- Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
- Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
- Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73 (6), 768-776 (2010).
- Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86 (1), 144-151 (2016).
- Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
- Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48 (6), 967-973 (2013).
- Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144 (1), 1-10 (2012).
- Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45 (9), 577-579 (1998).
- Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (1), (2010).
- Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147 (6), 789-801 (2014).
- Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
- Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32 (4), 440-446 (2016).
- Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
- Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
- Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
- Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
- Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13 (3), 221-228 (1987).
- Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127 (1), 65-71 (2000).
- Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11 (2), e0148661 (2016).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
- Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79 (7), 1124-1129 (2013).
- Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
- Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
- Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
- Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
- Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
- Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21 (1), 49-53 (2017).
- Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 483-487 (1982).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos?. Theriogenology. 76 (4), 652-657 (2011).
