Incorporar un cyclopropene derivado de la lisina de anticuerpos permite la vinculación específica, rápida y eficiente de moléculas tetrazina-cojinete para generar fármacos de anticuerpos conjugados.
Conjugados de anticuerpos-drogas (ADCs) utilizadas en la actualidad en la práctica clínica son mezclas de moléculas de anticuerpo ligadas a un número variable de toxinas en diferentes posiciones. Estudios preclínicos han demostrado que se puede mejorar el índice terapéutico de estos ADCs tradicionales por la vinculación específica de toxinas. Sin embargo, enfoques actuales para producir ADCs homogéneas tienen varias limitaciones, como expresión de la proteína bajo y cinética de reacción lenta. En este protocolo se describe cómo configurar un sistema de expresión incorporar un cyclopropene derivado de la lisina (CypK) de anticuerpos mediante la expansión del código genético. Esta manija de bioorthogonal mínima permite rápida Conjugación de tetrazina derivados a través de una cicloadición de Diels-Alder de demanda inversa. El sistema de expresión aquí registrado permite la fácil producción y purificación de trastuzumab con CypK en cada una de las cadenas pesadas. Explicamos cómo vincular el anticuerpo para la toxina monometil auristatin E y caracterizar el immunoconjugate por cromatografía de interacción hidrofóbica y espectrometría de masas. Finalmente, se describen los ensayos para evaluar la estabilidad en suero humano de la vinculación de dihydropyridazine resultante de la conjugación y la citotoxicidad selectiva de la ADC para las células de cáncer de mama con altos niveles de HER2 receptor de prueba.
Conjugados de anticuerpos-drogas (ADCs) combinan la selectividad de biotherapeutics y la potencia de pequeñas moléculas citotóxicas. ADCs mayoría pretenden disminuir los efectos secundarios de la quimioterapia tradicional dirigiéndose a drogas que afectan la polimerización de ADN o los microtúbulos de las células de cáncer1. ADC primera generación aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) se basan en la modificación de lisinas y cisteínas, que genera mezclas de moléculas modificadas en diferentes posiciones con propiedades farmacocinéticas disminución2. Por el contrario, la conjugación específica de fármacos para los anticuerpos puede generar compuestos con mejores índices terapéuticos3,4. Tratando de enfrentar el desafío de producir ADCs homogéneas, varias modificaciones químicas y enzimáticas selectivas han sido reportados1,5. Sin embargo, los métodos actuales pueden apuntar sólo cierta posición en el anticuerpo, sufren de expresión de la proteína baja, proporcionan a enlazadores con baja estabilidad o dependen de reacciones lentas y bajo rendimiento.
Incorporación de los aminoácidos no-canónico (ncAA) a través de la expansión del código genético permite la instalación site-specific de una plétora de grupos reactivos bioorthogonal en proteínas, potencialmente superar las limitaciones de otros métodos utilizados para generar ADCs. Codificación ncAAs en respuesta a un codón de destino (parada) se basa en pares de sintetasa/tRNA de aminoacyl-tRNA que son ortogonales a los pares endógenos que incorporan aminoácidos canónicos6. NcAAs varios se han incorporado en anticuerpos para generar ADCs. Sin embargo, más sufren diversos pasivos para aplicaciones en la conjugación de drogas terapéuticas. p-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 no es totalmente bioorthogonal, requiere un pH bajo (4.5) y tiempos de reacción largos (> 60 h), mientras azides como p-azidophenylalanine (pAzF)7,9,10, p-azidomethylphenylalanine (revocación)11y un derivado de la azida de lisina (AzK)12,13 pueden ser reducida en la celda14, y el cobre utilizado para catalizar la actividad de Huisgen puede inducir daño oxidativo 15.
Aunque ncAAs alternativo basado en transporte-cyclooctene (TCO), cyclooctyne (SCO) y bicyclo [6.1.0] nonene (BCN) recientemente han sido codificados en un anticuerpo para los propósitos de la bio-proyección de imagen, el sistema de expresión sufre de rendimientos muy bajos (0,5 mg/L)16. Por otra parte, cyclooctenes y cyclooctynes son grandes y manijas hidrofóbicas que pueden aumentar la susceptibilidad de la ADC para cargas útiles -ADC de agregación son tradicionalmente hidrofóbicos y las propiedades fisicoquímicas de la máquina para hacer chorizos han demostrado mucho farmacocinética e índice terapéutico impacto17. Por el contrario, cyclopropenes 1,3-disubstitued son pequeños grupos reactivos que deben causar la mínima alteración en la proteína estructura y physichochemical propiedades18. Cyclopropenes selectivamente y rápidamente reaccionan con tetrazines a través de una de cicloadición de Diels-Alder de demanda electrónica inversa19. En el presente Protocolo hacemos uso de un derivado del cojinete de la lisina (CypK, Figura 1b) un cyclopropene de metilo que es menos afectada por impedimento estérico que ciclos insaturados filtrados más grandes y tiene una constante de velocidad de reacción en el orden 1-30 M-1s -1 en medio acuoso18,20.
Recientemente nos informó cómo incorporar CypK en anticuerpos para generar ADCs reaccionando este mango mínimo bioorthogonal con moléculas de tetrazina-cojinete21. Aquí describimos el procedimiento de preparación de ADC más detalladamente con énfasis en los pasos más difíciles. La incorporación de CypK se dirige con una pyrrolysyl-tRNA sintetasa (PylRS) / tRNACUA(PylT) par en respuesta a un codón ámbar introducido en la cadena pesada del anticuerpo (HC)22. Aquí utilizamos dos plásmidos para transfección transitoria (Figura 1a), codificación de la cadena pesada del anticuerpo y el otro codificación de la cadena ligera (LC), ambos que contienen el cassette de PylRS/PylT. Alternativamente, una línea celular estable que permite rendimientos más altos del anticuerpo puede ser generada a través de una más laborioso procedimiento21.
Los sistemas de la expresión anterior pueden producir la inmunoglobulina anti-HER2 terapéutico 1 (IgG1) trastuzumab con CypK en niveles similares a los anticuerpos de tipo salvaje. Seleccionamos la primera posición el dominio CH1 de la cadena pesada para codificar la ncAA (HC-118TAG). Este es el sitio más comúnmente modificado en ADCs23 y es conocida como HC-118 (enumeración de EU) pero también ha sido conocido como HC-121 (posición de la secuencia) y HC-114 (enumeración de Kabat)24. Desde esta posición se conserva a lo largo de los IgG1s, estos sistemas de expresión deben ser susceptibles a los anticuerpos más terapéuticos.
Mostramos trastuzumab(CypK)2 puede ser fácilmente purificado de proteína A seguido por cromatografía líquida rápida de proteínas con una columna de interacción hidrofóbica (HIC-FPLC). Posteriormente, el anticuerpo es covalente dentro de 3 h a la polimerización de microtúbulos inhibidor monometil auristatin E (MMAE), que se utiliza en el ADC Adcetris aprobados por la FDA. Aquí utilizamos un derivado bencílico tetrazina MMAE (tetrazina-vcMMAE) con un enlazador que comprende un espaciador glutarato y un componente lábil de proteasa valina-citrulina seguido de una unidad self-immolative p– aminobenzylalcohol; Este enlazador es dividido por la catepsina B en el lisosoma en la internalización de la ADC resultando en la liberación sin dejar huellas de la toxina25. Para demostrar la amplitud de la reacción, que el anticuerpo también está vinculado a la tetramethylrhodamine del fluoróforo (TAMRA). Explicamos cómo verificar la identidad del conjugado por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) y calcular la relación droga-anticuerpo (DAR) mediante cromatografía líquida de alto rendimiento con una columna de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC) .
Como parte de la caracterización de la actuación de anticuerpos, se describe cómo comprobar la estabilidad de la articulación dihydropyridazine en suero humano. Este parámetro se evalúa más fácilmente en trastuzumab-TAMRA porque puede cuantificarse mediante un ELISA simple y no se complica la interpretación de los resultados por el componente lábil de la proteasa de trastuzumab(MMAE)2. Por último, la selectividad y la potencia de trastuzumab(MMAE)2 se evalúa comparando la citoxicidad de la ADC a través de las líneas celulares que expresan diferentes niveles de HER2. Este análisis también proporciona una prueba funcional de la estabilidad de la ADC cuando se realiza después de la incubación el immunoconjugate en suero humano.
El procedimiento de expresión transitoria para producir trastuzumab(CypK)2 descrito en el presente Protocolo es simple y permite alta modularidad. Los rendimientos obtenidos están dentro de los esperado en un entorno académico27 y líneas celulares estables pueden generarse para potenciar aún más el rendimiento de producción21. Durante la expresión, las concentraciones de CypK inferiores a 5 mM puede resultar en menor incorporación de ncAA, y cantidades mayores pueden afectar crecimiento celular y disminuir la producción de anticuerpos. CypK como un aminoácido libre tiene solubilidad de agua baja, así deben ser primero disuelto en 100 mM de 0,1 M NaOH y luego se añadió al medio de cultivo. Después de diluir el CypK en el medio y antes de agregar a las células, es esencial para neutralizar el medio con ácido clorhídrico y el filtro para esterilizar. Posteriormente, utilizando los reactivos de transfección especificado en el presente Protocolo y siguiendo los tiempos de incubación recomendados por el fabricante es importante para una expresión de alto rendimiento. Para obtener más información sobre expresión transitoria de anticuerpos humanos, el lector es referido a otros protocolos publicados31,32.
Cuando el anticuerpo se purifica, un alto exceso de resina de proteína es necesario como se indica para anticuerpo completo desplegable desde el sobrenadante. Para prevenir la precipitación de trastuzumab durante la elución, es recomendable utilizar una solución con tampón de alta capacidad, diluir inmediatamente con PBS y el búfer de evitar una concentración excesiva de intercambio. Mantenga siempre el anticuerpo < 5 mg/mL.
La conjugación de trastuzumab(CypK)2 con tetrazina-vcMMAE es más rápida que la mayoría de las reacciones registrada con otras asas bioorthogonal para ADCs. Por otra parte, esta cycladdition se produce en condiciones muy suaves: temperatura ambiente o inferior y fisiológico pH. Es importante diluir las soluciones stock de DMSO de los reactantes con acetonitrilo antes de la adición de PBS y el anticuerpo; de lo contrario precipitará los tetrazina derivados. Acetonitrilo se requiere solamente debido a la alta hidrofobicidad de MMAE y TAMRA, pero menos moléculas hidrofóbicas no necesita la adición de un co-solvente. Alternativamente, puede ser conjugado tetrazina-vcMMAE sin acetonitrilo y solamente 2 equivalentes molares de tetrazina-vcMMAE dentro de las 20 h. Esta pequeña cantidad de la toxina podría implicar una disminución substancial en el costo de fabricación de ADC en comparación con las tecnologías actuales basadas en la ncAA. Trastuzumab(CypK)2 es totalmente reactivo durante al menos 4 meses cuando se conserva a 4 ° C.
HPLC-HIC permite una determinación exacta de DAR ya MMAE es altamente hidrofóbico y proporciona una excelente resolución de los picos correspondientes a los anticuerpos conjugados con toxinas de 0, 1 y 2. Tetrazina-vcMMAE elutes alrededor de 13,7 minutos y se detecta a 280 nm. Esta técnica requiere un material de partida de alta pureza. Por otra parte, no es recomendable para calmar la reacción con otras moléculas reactivas con tetrazina como BCN-OH ya que ellos pueden alterar los tiempos de retención y la forma de los picos. Es esencial que la concentración de sal de las muestras coincide con uno en la fase móvil en el comienzo del degradado para obtener una buena separación, especialmente si se inyecta más de 10-20 μl.
En relación con el análisis de LC-MS, deglycosylation de las muestras de anticuerpos es necesaria para obtener un solo pico en deconvolución del espectro crudo. La exactitud del anticuerpo total y masas de ADC puede variar dependiendo de la calibración del instrumento. Por lo tanto, para calcular la masa de la modificación, restar la masa obtenida de los anticuerpos no modificados del obtenido por el ADC. Modernos espectrómetros de masas de alta resolución deben proporcionar un error relativo debajo de 1:10000. Aunque LC-MS también puede utilizarse para calcular la relación entre las diferentes especies, este valor suele ser una sobrestimación porque la modificación puede afectar la capacidad de ionización de las especies generadas y no se pueden detectar pequeñas cantidades de impurezas.
La estabilidad de la máquina para hacer chorizos en ADCs es crítica debido a la liberación prematura del fármaco mayor toxicidad y menor eficacia; la citotoxina libre daña los tejidos sanos y el anticuerpo desnudo compite con el armado de los sitios de unión de destino de las células enfermas. Un lanzamiento por debajo del 5%, que está dentro de la variabilidad de la prueba de estabilidad, es de esperarse.
Por último, la selectividad de un ADC dirigida a HER2 como trastuzumab(MMAE)2 puede evaluarse mediante la comparación de la citotoxicidad en células de SK-BR-3 (alta de HER2) y células de MCF-7 (HER2 baja) desde el último expresan 15 dobleces menos receptores HER2 que el anterior28 . El immunoconjugate es que resulte en una viabilidad celular al menos 2 órdenes de magnitud menores en SK-BR-3 comparado con MCF-7. CE50 en SK-BR-3 debe estar en el rango nanomolar de dos dígitos que refleja la alta potencia de este ADC29,30. El anticuerpo sin modificar, trastuzumab(MMAE)2 o trastuzumab, no debe mostrar ninguna toxicidad en este ensayo. Tetrazina-vcMMAE debe tener un efecto de 3 órdenes de magnitud menor que la ADC desde el vinculador quita la actividad de la toxina de peptidomiméticos. Por el contrario, porque MMAE es capaz de penetrar la membrana de la célula30, debe tiene una toxicidad similar a la ADC pero no mostrar ninguna discriminación entre HER2 altas y líneas de celulares baja de HER2. Por otra parte, si este ensayo se realiza después de una incubación de 5 días de la ADC en suero, puede ser utilizado para proporcionar una prueba funcional de la estabilidad de la máquina para hacer chorizos: daría lugar una liberación de la toxina en cualquiera una disminución en la eficiencia de la ADC en SK-BR-3 si MMAE fue liberado p arte de la máquina para hacer chorizos o una disminución en la selectividad si el vinculador fue hendido de manera sin dejar huellas.
La tecnología ADC descrita permite la incorporación eficiente y específica de un derivado del cyclopropene de lisina en IgG1s. Después de una purificación fácil, anticuerpos pueden ser rápidamente conjugados con moléculas que contienen la tetrazina, obtención de productos homogéneos. Debido al pequeño tamaño y alta reactividad del cyclopropene mango mínimo, este método debería permitir la conjugación de cargas sterically obstaculizados. El immunoconjugates resultantes es estables en suero y son muy potentes y selectivos. En general, CypK permite un acoplamiento de bioorthogonal rápida, específica y estable de anticuerpos y otras proteínas conjugados para usarse en terapia o en diagnóstico.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el Medical Research Council, UK. S. B.O. es una beca de la EMBO (P.E.N. 158-2016) y a H. Pelham y J.W. barbilla para apoyo y G. Kym, C. W. Morgan y O. Perisic por ayuda y Consejo.
Expi293F | ThermoFisher Scientific | A14527 | HEK suspension cells |
Expi293 Expression Medium | ThermoFisher Scientific | A1435101 | Expression medium |
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Penicillin-streptomycin-amphotericin B |
125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap | Corning | 431143 | Shake flasks |
Brunswick S41i incubator | Eppendorf | S41I230011 | CO2 incubator with a shaker |
Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution | VWR | 191373M | |
Cyclopropene lysine | Sichem | SC-8017 | In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014 |
Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated | Merck Millipore | SCGP00525 | |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced serum medium |
ExpiFectamine 293 Transfection Kit | ThermoFisher Scientific | A14525 | Transfection reagent |
5810 R centrifuge | Eppendorf | 5811000460 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Protein A resin | Sino Biological | 10600-P07E-RN-25 | |
Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50 | Bio-Rad | 7311550 | Polypropylene chromatography column |
Econo-Column Funnel | Bio-Rad | 7310003 | |
Sodium citrate | Fluka | 71635 | |
ÄKTA explorer FPLC | GE Healthcare | ||
HiTrap HIC Selection Kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes HiTrap 1 mL Butyl HP |
Ammonium sulfate | VWR | 2133.296 | |
Isopropanol | Honywell | 34863-2.5L | |
Dymethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
Tetrazine-vcMMAE | ChemPartner | – | Costum synthesized |
Tetrazine-5-TAMRA | Jena Bioscience | CLK-017-05 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well | ThermoFisherScientific | NP0321BOX | |
Xcell SureLock Mini-Cell | ThermoFisherScientific | EI0001 | |
UltiMate 3000 HPLC | ThermoFisherScientific | ||
Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm | ThermoFisherScientific | 088553 | |
PNGase F | New England BioLabs | P0704S | |
NanoAcquity | Waters | ||
C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column | Waters | ||
96-well microplates for cell culture | ThermoFisherScientific | 156545 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522-20mL | |
CO2 incubator | Panasonic | ||
HER2 ECD | Sino Biological | 10004-HCCH | |
Anti-TAMRA | Abcam | an171120 | |
Anti-mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
TMB | BioLengend | 421101 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 84727-500ML | |
PHERAstar FS | BMG Labtech | Plate reader | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671-500ML | |
SK-BR-3 | ATCC | HTB-30 | |
MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
CellTiterGlo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence. |
Monomethyl Auristatin E | Cayman Chemical | 16267 | |
NanoDrop 2000 | ThermoFisherScientific | Microvolume spectrophotometer | |
Human IgG ELISA Quantificaiton Set | Bethyl | E80-104 | |
MaxEnt1 in MassLynx | Waters | Software application for mass spectrum deconvolution | |
IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay) | Epitope Diagnostics, Inc. | KTR 782 | |
Tube 50 mL, 114x28mm, PP | Sarstedt | 62.547.254 | Conical tube |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC905024 | Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down) |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC805024 | Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification) |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | ThermoFisherScientific | 89882 | Size exclusion spin columns |
Tube PCR 0.2ml Flat Cap | Thistle Scientific Ltd | AX-PCR-02-C-CS | PCR tubes |
Nunc MaxiSorpª flat-bottom | ThermoFisherScientific | 44-2404-21 | Plates for ELISA |