אפיתל שחיקה הקרנית עם עינית Burr כמודל עבור קרנית ריפוי פצעים
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי לגרום של שחיקה השטח עינית של העכבר, בצע את לאחר מכן תהליך ריפוי הפצע. הפרוטוקול מנצל burr עינית חלקית להסרת האפיתל פני השטח של העין בעכברים מרדימים.
Abstract
הקרנית מאתר מספק מודל מצויין ללמוד ריפוי הפצע. הקרנית היא השכבה החיצונית ביותר של העין, וכך היא ההגנה הראשונה לפגיעה. למעשה, הוא הסוג הנפוץ ביותר של פגיעת עין שנמצאו קליניקה שחיקה הקרנית. כאן, אנו מנצלים של burr בעדשת העין לזירוז של שחיקה וכתוצאה מכך הסרת אפיתל הקרנית ויוו על עכברים מורדם. שיטה זו מאפשרת להפרעה יישוב, לשחזור אפיתל, עוזב בתחומים אחרים ללא פגע. בנוסף, אנו מתארים את הפריט החזותי של האפיתל משופשפים עם fluorescein מכתים, לספק ייעוץ קונקרטי על דרך להמחיש את הקרנית משופשפים. לאחר מכן, אנו עוקבים אחר ציר הזמן של ריפוי 0, 18 ו- 72 h לאחר שחיקה, עד שהפצע הוא epithelialized מחדש הפצע. המודל שחיקה אפיתל הקרנית הפגיעה הינו אידיאלי עבור מחקרים על התפשטות תאים אפיתל, הגירה, epithelialization מחדש של השכבות הקרנית. עם זאת, שיטה זו אינה אופטימלית ללמוד הפעלה סטרומה במהלך ריפוי הפצע, כי burr עינית שאינה לחדור אל הרבדים תאי סטרומה. שיטה זו מתאימה גם ליישומים קליניים, לדוגמה, ניסויים פרה-קליניים מבחן של יעילות התרופה.
Introduction
שכבות אפיתל של איברים רבים נחשפים לפציעות. עם זאת, הם גם מכילים את היכולת לפצות על אובדן הרקמות דרך ריפוי הפצע. הקרנית מציע מודל מצויין ללמוד ריפוי הפצע. זה יוצר על המשטח החיצוני של העין ומספק שכבת הגנה מכונות רישיות עינית. לפיכך, קרנית פונקציות כמו גדר ההפרדה גורמי מחלה, אובדן מים. הוא מורכב משלוש שכבות; האפיתל, משתית, אנדותל. האפיתל של הקרנית הופכת את השכבה החיצונית ביותר של הקרנית. תאים אפיתל לשמור על הפונקציה מכשול של הקרנית על ידי הקפדה זו לזו דרך צמתי צר1,2,3. Acellular הקרנית קרום המרתף, הקרום של באומן, מהנוזל האפיתל stroma מקיף, המכיל keratocytes עקשן. תחת stroma, תאי אנדותל ערוץ חומרים מזינים מים, חמצן על השכבה העליונה.
שריטות הקרנית נפוצים מאוד המרפאה4. פציעות בקרנית מגוונים, אך במידה רבה נגרמות על ידי חלקיקים קטנים כגון אבק או חול, שריטות או חפצים זרים אחרים. הפרוטוקול המתוארים כאן מטרות-להתרבות סוג הרלוונטית קלינית של שחיקה אפיתל הקרנית. בעשותו כן, פרוטוקול זה מספק שיטה לשליטה הזרע רופאים ומדענים הקרנית ליישם במחקרים משלהם. אנחנו שביצעת ויוו פציעה תיקון assay על הקרנית מאתר מאת ששרט את הרקמה עם צמח קוצני עינית dulled, השני Algerbrush. כאן, אנחנו למקד את השריטה רק על האפיתל הקרנית המרכזית ולהשאיר חלקים אחרים של איבר המין ללא נזק. כך, הפרוטוקול הוא אידיאלי כדי מחקר תאים אפיתל הקרנית דינמיקה או קרום המרתף במהלך epithelialization מחדש, התא ההעברה, התפשטות ובידול ויוו5. לאחרונה, מודל זה שימש כדי לנתח קדמון dynamics תא הקרנית מאתר כמו גם כדי לחשוף את היכולת של תאי אפיתל הקרנית הבדיל ביצירה מחדש את גומחת תאי גזע הקרנית לאחר פציעה6,7. בעקבות שחיקה, הקרנית חוזר חוזק ובשקיפות הרגיל שלה. מעניין, במחקר במבחנה ציינו שאת epithelialization מחדש תתרחש ללא התפשטות תאים מוגברת8. פרוטוקול זה מתאר את ציר הזמן של ריפוי ללא הפרעה הקרנית מאתר. השיטה ישימה ובכך לבחון את השפעת הסמים על ריפוי דפוסים ומהירות.
הקרנית כבר בשימוש נרחב עבור לימודי ריפוי הפצע. עם זאת, מחקרים רבים צריכים לסמוך על דגמים אחרים של פציעה. מודל ומבוססת של פגיעה הקרנית היא הכוויה אלקליין שהתבצעה על-ידי החלת הידרוקסיד הנתרן (NaOH) עם או בלי נייר סינון על פני הקרנית9. חשיפה אלקליין גורמת פגיעה גדולה, ‘ מאטום לשקוף ‘ משפיעה לא רק על אפיתל הקרנית, אלא גם את לחמית, משתית9,10. פתרונות אלקליין חזקה הוכחו לגרום כיבים הקרנית, opacification וכורוידאלית9. תאים דלקתיים לפלוש stroma בדרך כלל תוך 6 שעות ולהישאר שם עד 24 שעות11. לכן, פגיעה אלקליין היא שיטה מומלץ במחקרים הקשורים להפעלה סטרומה. סוג אחר של פגיעה כימיים יכולים להנחיל על-ידי החלת דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)9,הקרנית10. דגמים אחרים פציעה נפוצים כוללים incisional פצעים החודרים דרך הפצעים stroma, keratectomy, אשר מוגבלים לחלק העליון של ה-14,משתית15. שיטות אלה שימושיים גם לענות על שאלות לגבי ריפוי הפצע סטרומה. פציעה שונות הדגמים יש יתרונות וחסרונות משלהם. שחיקה, או הטריה, של האפיתל הקרנית פותחה לראשונה באמצעות ואזמלי מנתחים הושלו או להבים שמחוץ לקרנית16. שיטה זו כבר מאוחר יותר בשימוש ב- vivo על עכבר, חולדה ארנבת17,18,19,20,21,22. באמצעות של burr עינית (איור 1), אנחנו להסיר רק אזור שנבחר של האפיתל, משאיר את שאר האפיתל מעושה. בדרך זו, זה אפשרי למקד בדיוק להסרת האפיתל לחלקים שונים של הקרנית. בנוסף, גודל שחיקה יכול להידרש עם fluorescein מכתים. יתר על כן, כאן אנו עוקבים אחר הסגר שחיקה במהלך תקופת ההחלמה.
שיטה זו מהווה מספר יתרונות, i) כולל מיקומו המדוייק של שחיקה האתר, שאינה אפשרית עם פגיעה כימית, ii) שחיקה מהירה לביצוע, השלישי) זה לא פולשנית. במסמך זה, אנו מתארים את השיטה באמצעות העכבר NMRI outbred כמודל, אולם זה יכול להיות מיושם במגוון רחב של דגמים גנטיים העכבר, כמו גם עכבר, ארנב, אשר הם הדגמים הנפוצים המשמשות ללימוד הפרעה הקרנית האנושית.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות ופצעו הם כלים פופולריים ללמוד היבטים שונים של הומאוסטזיס הקרנית, פתולוגיות. המודל שחיקה מציע שיטה ומבוקרות היטב כדי לטפל בבעיות רלוונטיות עיניים. עם זאת, נקודות קריטיות מסוימות בפרוטוקול שווים תוך שימת דגש. ראוי לציין, הפרטים המפורטים לגבי רפואה וטרינרית, ציר זמן ריפוי הפצע, ו התוצא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות Ikkala קאיזה שלה בפז סיוע טכני, תובנה עזרה בעת שמצדדי בשיטה זו, כמו גם בהמשך במהלך הביצוע שלנו שאלות מחקר מרכזי. אנחנו גם רוצה להודות לה עזרה בתכנון הקווים המנחים של העבודה וטרינרית מעבדה חיה במרכז, אנה מלר.
Materials
| NMRI mouse | Envigo | 275 | |
| 0.9% NaCl | use sterile | ||
| Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
| Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
| Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
| Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
| Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
| 1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
| Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
| Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
| Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
| Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
| Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
| Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
| Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
| Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
| CO2 chamber | |||
| Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
| Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
| 26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
| 2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
| Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
| Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
| Xylene | VWR | UN1307 | |
| Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
| Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
| Microtome | Microm | HM355 | |
| Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
| Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
| Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |
References
- Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
- Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
- Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
- Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
- Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
- Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936 (2012).
- Bai, J. -. Q., Qin, H. -. F., Zhao, S. -. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
- Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
- Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
- Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).
- Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. 발생학. 92 (1), 259-262 (1982).
- Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
- Lyu, J., Joo, C. -. K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
- Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776 (2015).
- Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
- Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
- Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- . Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018)
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
- Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
- Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
- Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).
- Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).
