뼈 재생을 위해 생체에서 생물학적 호환성 프로필
Summary
큰 뼈 장애 복구에 대 한 설계 새로운 생체 재료의 수는 지속적으로 뼈 이식 수술과 관련 된 합병증을 극복 하 고 뼈 치유 향상을 목표로 확장 됩니다. 여기, 우리는 뼈 수리에 대 한 생체의 전 임상 생체 적합성 테스트를 위한 종합 전략을 제시.
Abstract
큰 비-연합 뼈 골절은 정형 외과 수술에 중요 한 도전입니다. 자동-및 수용자 뼈 이식 같은 병 변 치유를 위한 훌륭한 있지만, 그들의 사용을 가진 잠재적인 합병증이 있다. 따라서, 물자 과학자는 이러한 문제를 극복 하기 위해 합성, 생체 바이오 소재 개발 하 고 있다. 이 연구에서 우리는 뼈 수리에 대 한 생체 재료를 평가 하기 위한 종합 플랫폼 제시. 우리는 뼈 생물학 및 면역학 생체 외에서 osteoclast (OC)와 osteoblast (OB) 분석 실험 및 뼈 수리, immunogenicity, 및 allergenicity의 마우스 모델 vivo에서 포함 하는 플랫폼을 개발 하는 전문성을 결합. 실험을 수행, 결과 요약 및 생체 적합성 소재에 보고 하는 방법을 보여 줍니다. 특히, 테스트 산부인과 생존, 차별화, 그리고 강화 작용 및 OC 생존 및 차별화 β tricalcium 인산 (β-TCP) 디스크의 맥락에서. 우리는 또한 뼈 치료의 초기 단계에 대 한 효과 결정 하기 위해 뼈 수리 calvarial 뼈 크기의 중요 한 결함 마우스 모델에 대 한 임상 사용 상용 물자 인 β-TCP/콜라겐 (β-TCP/C) 거품을 테스트. 병렬 실험에서 우리는 쥐의 면역 및 알레르기 반응을 평가. 우리의 접근 방식은 다양 한 매개 변수 뼈 치유 및 복구 환자에 사용 하는 생체 재료의 생체 적합성 예측에 필요한 뼈 소재의 생물학 호환성 프로 파일을 생성 합니다.
Introduction
뼈 수리 혈 종 형성, 염증으로 시작 하는 복잡 한 과정, callus 형성 및1,2를 개장 하는 다음. 그러나, 뼈 재생 잠재적인 뼈 골절1,3의 크기로 제한 됩니다. 예를 들어, 큰 뼈 골절 외상, 암이 나 골다공증으로 인 한 치유 되지 않을 수 있습니다 그리고 비 연합 뼈 골절을 불린다. 이러한 뼈 병 변은 종종 건강 한 생리 뼈 수리 및 재생을 촉진 하는 치료를 필요로 합니다. 현재, autograft와 이식 뼈 이식 선택4 2.2 백만 뼈 대체 절차의 접근은 매년5. 비록 이러한 절차 높은 성공률을가지고, 합병증, 예를 들어 제한 된 가용성 뼈, 감염, 기증자 사이트 사망률, 그리고 거부4의 있을 수 있습니다. 뼈 조직 공학에 대 한 새로운 대안 이러한 과제를 해결 하기 위해 모색 되 고 있다.
천연 또는 합성 고분자, bioceramics 또는 세포 및 생리 활성 분자와 함께 금속 기반 생체 재료의 설계는 상승6에. 생리 뼈 치유와 생체의 맥락에서 치유의 우리의 현재 이해 기계적 특성 등 여러 요인 및 순환 및 골절 사이트7에서 셀을 포함 하 여 여러 로컬 및 조직 요인에 따라 달라 집니다. ,,89. 뼈 재생을 위한 바이오 osteogenicity 및 osseointegration10 홍보 하는 것을 목표로 고 이상적으로 생체, 생 분해성, 다공성 (추진 셀 마이그레이션, 산소, 영양분) 이다. 그들은 또한 고통을 구호 하 골절 사이트를 지원 하기 위해 충분히 강할 필요가. 또한, 선 동적인 요인 치유 과정을 시작 하려면 필요 합니다. 그러나, 경우는 소재는 과도 한 염증 및 알레르기 성 응답을 유도, 제한 하거나 뼈11,12치유를 억제 수 있습니다이. 따라서, 학 제 적인 접근은 뼈 수리를 위해 개발 하는 바이오 소재를 평가 하는 데 필요한.
이 연구에서는 거품 tricalcium 인산 염으로 구성 된 상용 수가 뼈 이식 대용품 이다 나노미터 크기의 순수한 β tricalcium 구성 1) Orthovita Vitoss 대표 물질의 전 임상 평가 소개 인산 (β-TCP) 입자와 유형 1 소 콜라겐 (C) (β-TCP/C 거품)과 2) β-TCP 디스크. 여기, 우리는 기본 osteoblast (OB)를 사용 하 여 이러한 생체 재료의 생체 적합성 테스트 설명 및 osteoclast (OC) 분석 실험, 뼈 복구, T 림프 구 확산 체 외에서 구성 된 면역학 평가의 vivo에서 모델 및 cytokine 생산, 그리고 vivo에서 immunogenicity allergenicity, 이전에 보고 된13.
Protocol
절차는 BALB/c 마우스 관심과 오스트리아 정부 교육, 과학 및 연구의 실험 동물의 사용에 대 한 모든 지침을 끝내 고 오스트리아 교육부, 과학의 윤리학에 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 연구입니다. 1. 기본 마우스 산부인과 문화 산부인과에서 신생아 마우스 calvaria 소화 효소를 사용 하 여 격리 1-2 일 된 신생아 강아지 (총에서 60) 잘린 여 euthanize …
Representative Results
Β-TCP 뼈 수리에 대 한 소재로 그것의 효과 대 한 평가, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 심사 방법 사용. 첫째, 우리는 초기 중간 혼자 컨트롤에 비해 β-TCP 디스크에 산부인과 응답 측정. 그림 2 문화의 7 및 14 일 OB 생존 β-TCP 디스크에 대 한 응답에서을 보여 줍니다. Β-TCP 디스크는이 소재는 강화도 산부인과 확산 억제를 나타내는 뿐만…
Discussion
여기, 우리가 대표적인 바이오 뼈 재생 및 복구에 대 한 개발에 대 한 생체 적합성의 전 임상 평가 대 한 다양 한 접근 방식을 보여줍니다. 우리 OBs, OCs의 응답을 테스트 하 고 중요 한 뼈의 결함의 에 비보 치유 응답 모델 쥐 뿐만 아니라 에 체 외 그리고 vivo에서 면역 반응. 우리는 분석 작업과 데이터와는 생체 재료의 시험에서 파생 된 결론을 요약 설명 목적입니다. 우리는 우?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구 프로젝트 부여 계약 번호 263363 아래 유럽 연합의 일곱 번째 기구 프로그램 (FP7 2007-2013 년)에서 자금을 받고 있다.
Materials
| Biomaterials | |||
| β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) | Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures. | ||
| Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) | Orthovita | 2102-1405 | |
| Mouse osteoblast culture | |||
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| ALP assay buffer (2x) pH 10.4 | Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10. | ||
| Bone growth medium (BGM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin | ||
| Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate | Thermo Scientific | C7027 | Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. |
| Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | A13261 | |
| Collagenase type IV from clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DC protein assay kit II | Bio Rad | 5000112 | DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Steril-filter DMSO before usage. |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | E12020 | EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C9002 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MEM alpha medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| Osteogenic mineralization medium (MM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate | ||
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Sigma-Aldrich | B5655 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15400054 | Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free | VWR | L0970-500 | |
| Wash buffer | Add 0.05% Tween20 to 1x PBS. | ||
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 1.08816 | |
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G5422 | |
| 24-well suspension culture plate | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| 50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 96-well black plate | Greiner bio-one | 655076 | |
| 96-well transparent plate | Greiner bio-one | 655001 | |
| Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2-Incubator: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Cryovial 2 mL | Greiner bio-one | 122263 | |
| Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 10462200 | For sterile filtration of enzyme solution. |
| Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo | Epson | ||
| Infinite M200 Pro microplate reader | Tecan | ||
| Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL | VWR | 20901-505 | |
| Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL | VWR | 21008-959 | |
| Shaker Swip (orbital and horizontal) | Edmund Buehler | ||
| Shaking incubator GFL3032 | GFL | 3032 | |
| Single-use pipet: serum pipet | Greiner bio-one | 612301 | |
| Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps) | |||
| Tissue culture plate (10 cm) | Greiner bio-one | 664960 | |
| Mouse osteoblast-osteoclast co-culture | |||
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma-Aldrich | 17936 | 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%) |
| Acetone | VWR Chemicals | 22065.327 | |
| Bone growth medium (BGM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin | ||
| Distilled water | Carl Roth | 3478.4 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | VWR Chemicals | 20821.365 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Fast red violet LB salt | Sigma-Aldrich | F3381 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| MEM alpha Medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Naphthol AS-MX phosphate | Sigma-Aldrich | N4875 | |
| Osteoclast differentiation medium (DM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 | ||
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Cayman Chemical Company | 9003016 | 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%) |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S8640 | |
| Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel) | |||
| TRAP buffer pH 5.0 | Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5. | ||
| Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free | VWR | L0970-500 | |
| 24-well suspension culture plate | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| 50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2-Incubator: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) | Buehler | ||
| Isomet low-speed saw | Buehler | ||
| Petri dish (6 cm) | Greiner bio-one | 628,161 | |
| Screw cap glass bottle 20 mL | Carl Roth | EXY4.1 | |
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Single-use pipet: serum pipet | Greiner bio-one | 612301 | |
| Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' | Henry Schein Animal Health | 9003340 | |
| Mouse calvarial defect model | |||
| Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) | Richter Pharma AG | ||
| Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) | Fresenius Kabi | ||
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4.5% buffered formalin | Carl Roth | 2213.6 | |
| Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL | B. Braun Surgical | 1050060 | |
| Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
| Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2'' | Henry Schein Animal Health | 9003340, 9003630 | |
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Sterile disposable scalpel (Figur 20) | Henry Schein Animal Health | 9008957 | |
| Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 16929000 | |
| Handpiece type S-II | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 30056000 | |
| Trephine, diameter 4 mm | Hager&Meisinger GmbH | 229040 | |
| Irrigation tubing set 2.2 m | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 4363600 | |
| Periosteal elevator 2 mm / 3 mm | Henry Schein Animal Health | 472683 | |
| Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm | Henry Schein Animal Health | 300715 | |
| In vitro immune responses | |||
| Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit | Sigma-Aldrich | 11647229001 | The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. |
| Concanavalin A (ConA) | MP Biomedicals | 150710 | |
| Culture medium splenocytes | RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids | ||
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| Gentamicin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15750037 | |
| Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Mouse IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
| Mouse IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
| Mouse INF-γ ELISA MAX Standard | BioLegend | 430801 | |
| Non-essential amino acids solution | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse | BD Bioscience | 555899 | |
| RPMI 1640 medium, HEPES | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 52400025 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| 50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 96-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| Cell strainer 40 µm | BD Bioscience | 352340 | |
| Infinite M200 Pro microplate reader | Tecan | ||
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Sterile surgical instruments (forceps, glass slides) | |||
| High throughput intraperitoneal model | |||
| Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Mouse IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
| Mouse IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit | Thermo Scientific | 9990700 | For differential cell count. |
| Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Hemocytometer: Neubauer chamber | Carl Roth | PC72.1 | |
| Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Resorbable suture: Polysorb | Covidien | SL-5628 | |
| Shandon centrifuge for cytopsin | Thermo Scientific | ||
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 | |
| Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Subchronic subcutaneous model | |||
| Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4.5% buffered formalin | Carl Roth | 2213.6 | |
| Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
| Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 | |
References
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Cite This Article
Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).