In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie
Summary
We beschrijven de methoden om te isoleren canine neutrofielen van volbloed en visualiseren van netto vorming in levende neutrofiele granulocyten met behulp van fluorescentie microscopie. Ook beschreven zijn protocollen te kwantificeren netto vorming en citrullinated Histon H3 (citH3)-expressie met immunofluorescentie microscopie.
Abstract
In reactie op de invasie ziekteverwekkers, vrijgeven neutrofielen neutrofiele extracellulaire vallen (netten), die de extracellulaire van DNA versierd met histonen en antimicrobiële eiwitten netwerken. Buitensporige netto vorming (NETosis) en citH3 release tijdens sepsis is gekoppeld aan meerdere orgaanstoornis en sterfte bij muizen en mensen, maar de implicaties ervan bij honden zijn onbekend. Hierin beschrijven we een techniek om te isoleren canine neutrofielen van volbloed voor observatie en kwantificering van NETosis. Leukocyten-rich plasma, gegenereerd door dextran sedimentatie, wordt gescheiden door verkrijgbare dichtheid verlopende scheiding media en granulocyten verzameld voor cel tellen en levensvatbaarheid testen. Om te zien hoe de realtime NETosis in levende neutrofielen, worden cel permeant en cel impermeant fluorescerende nucleïnezuur vlekken toegevoegd aan de neutrofielen geactiveerd door lipopolysaccharide (LPS) of phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA). Veranderingen in nucleaire morfologie en netto vorming worden waargenomen na verloop van tijd door fluorescentie microscopie. In vitro NETosis wordt verder gekenmerkt door co-colocalization van cel-gratis DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) en citrullinated Histon H3 (citH3) met behulp van een gemodificeerde dubbel-immunolabelling-protocol. Om objectief te kwantificeren netto vorming en citH3 expressie met behulp van fluorescentie microscopie, netten en citH3-positieve cellen worden gekwantificeerd in een geblindeerde wijze met behulp van beschikbare software. Deze techniek is een specifieke bepaling voor de evaluatie van de capaciteit in vitro van canine neutrofielen NETosis ondergaan.
Introduction
Neutrofielen zijn kortstondige granulocyten die verantwoordelijk is voor de eerste verdediging tegen invasie ziekteverwekkers. Neutrofiele granulocyten, gerekruteerd om de plaats van de infectie, elimineren micro-organismen door fagocytose, degranulatie en generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS)1. In aanwezigheid van bacteriën en endotoxines versierd neutrofielen release neutrofiele extracellulaire vallen (netten), samengesteld uit extracellulaire chromatine met histonen en korrelig eiwitten zoals elastase en myeloperoxidase (MPO)2. Netten weliswaar onmisbaar antimicrobiële eigenschappen, suggereert verhoging van experimentele en klinisch bewijs dat overijverige netto formatie tijdens sepsis tot meerdere orgel dysfunctie en dood3,4, leiden kan 5 , 6.
Omdat netten een soortgelijke pathofysiologische rol bij honden spelen kunnen, kunnen therapeutische ingrepen die ofwel voorkomen of verminderen van netto vorming dienen als roman behandelingsstrategieën in septische dieren. Om deze reden is er een behoefte aan een betrouwbare techniek voor het beoordelen en kwantificeren van NETosis en netto onderdelen bij honden. NETTO componenten zoals cel-gratis DNA (cfDNA) en nucleosomes zijn eerder geëvalueerd in canine neutrofielen en plasma van klinische honden7,8,9. Met behulp van fluorescentie testen, Goggs en Letendre gevonden dat septische honden hogere niveaus van cfDNA dan gezonde honden8 hebben. Hoewel deze technieken zeer objectieve en kwantitatieve zijn, is meting van cfDNA en nucleosomes als markeringen van NETosis niet-specifieke aangezien zij necrotische cellen dan NETosing neutrofiele granulocyten kunnen worden ontleend. Hier beschrijven we een techniek die gebruik maakt van fluorescentie microscopie te onderzoeken van de gedragingen van de neutrofiele granulocyten live NETosing. We detail ook een gewijzigde protocol, met behulp van dubbel-immunolabeling te subjectief kwantificeren netten en hun onderdelen zoals MPO en citH3 in canine neutrofielen10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij presenteren hier een protocol om te zien hoe de veranderingen in kernen bevleesdheid en cfDNA release in levende canine neutrofiele granulocyten met behulp van zowel een cel permeant kleurstof en een cel impermeant kleurstof. Het belangrijkste voordeel van deze test is dat het mogelijk voor real-time detectie van netto vorming door high-resolution microscopie in levende neutrofielen zonder cel fixatie, daarom bieden een eenvoudige en waardevolle tool maakt voor de naleving van de in vitro netto vorming. Aang…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De overeenkomstige auteur werd gefinancierd door de Stichting dier Morris (D15CA-907). De studie werd gesteund door fondsen van de Universiteit van Californië, Davis, Center voor de gezondheid van de paarden en Center for Companion Animal Health (2016-24-F). De auteurs wil erkennen Geena Ng voor haar hulp bij de cijfers en Nghi Nguyen voor haar hulp bij de video.
Materials
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
- Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
- Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
- Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. 생화학. 45 (39), 11727-11736 (2006).
