यहां, हम एक सीटू संकरण परख जो संवेदनशील और एकल-कोशिका स्तर पर एकल न्यूक्लियोटाइड संकल्प के साथ ५० न्यूक्लियोटाइड के रूप में कम के रूप में दृश्यों का विशिष्ट पता लगाने में सक्षम बनाता है का वर्णन । परख, जो मैंयुअल रूप से या स्वचालित रूप से किया जा सकता है, ब्याह वेरिएंट के दृश्य सक्षम कर सकते हैं, छोटे दृश्यों, और ऊतक संदर्भ में उत्परिवर्तनों ।
क्योंकि सटीक दवा अत्यधिक पर निर्भर करता है के सटीक का पता लगाने के मार्क्स, वहाँ मानकीकृत और मजबूत प्रौद्योगिकियों के लिए एक बढ़ती जरूरत है कि उपाय के नैदानिक नमूनों में सीटू में आरएनए के मार्क्स. जबकि पीस और RNAseq और मात्रात्मक RT-पीसीआर की तरह बांध परख अत्यधिक संवेदनशील जीन अभिव्यक्ति माप सक्षम करते हैं, वे भी आरएनए निष्कर्षण की आवश्यकता होती है और इस तरह रूपात्मक ऊतक संदर्भ के भीतर मूल्यवान अभिव्यक्ति विश्लेषण को रोकने के । में सीटू संकरण (ISH) परख यहां वर्णित आरएनए लक्ष्य अनुक्रम का पता लगाने के रूप में कम के रूप में ५० न्यूक्लियोटाइड एकल-न्यूक्लियोटाइड संकल्प पर और एकल सेल स्तर पर कर सकते हैं । इस परख पहले विकसित वाणिज्यिक परख के पूरक है और संवेदनशील और ब्याह वेरिएंट, लघु लक्ष्य, और ऊतक के भीतर बिंदु उत्परिवर्तनों की सीटू का पता लगाने में विशिष्ट सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल में, जांच दो नैदानिक महत्वपूर्ण ब्याह वेरिएंट, EGFRvIII और METΔ14 के लिए अद्वितीय एक्सॉन जंक्शनों को लक्षित करने के लिए डिजाइन किए गए थे । लघु लक्ष्य अनुक्रम का पता लगाने के विशिष्ट पता लगाने के द्वारा प्रदर्शन किया गया था टी-सेल रिसेप्टर्स α और β Jurkat टी-सेल लाइन में CDR3 अनुक्रम. यह भी दिखाया गया है आरएनए के भेद के लिए इस ISH परख की उपयोगिता एकल-न्यूक्लियोटाइड संकल्प (बिंदु उत्परिवर्तनों) में EGFR L858R और KRAS G12A के दृश्य के माध्यम से एकल-सेल लाइनों में न्यूक्लियोटाइड रूपांतरों स्वचालित धुंधला का उपयोग प्लेटफार्मों. संक्षेप में, प्रोटोकॉल एक विशेष आरएनए ISH परख है कि ब्याह वेरिएंट, छोटे दृश्यों का पता लगाने में सक्षम बनाता है, और मैनुअल प्रदर्शन के लिए और स्वचालित दाग पर सीटू में उत्परिवर्तन से पता चलता है ।
उच्च-प्रवाह transcriptomic प्रौद्योगिकियों जैसे microarrays और अगली-gen आरएनए अनुक्रमण (RNAseq) तेजी से नैदानिक, शकुन, और सहित विभिन्न रोगों के लिए पूर्वानुमानित नैदानिक मूल्य के साथ आरएनए के निशान की खोज में सुधार हुआ है कर्क1,2. परिशुद्धता दवा में इन के प्रयोग अग्रिम करने के लिए, वहां मानकीकृत और मजबूत प्रौद्योगिकियों कि नैदानिक नमूनों के ऊतक संदर्भ के भीतर आरएनए के लिए उपाय कर सकते है के लिए एक उच्च की जरूरत है । जबकि व्यापक रूप से स्थापित पीसने और RNAseq और मात्रात्मक आर सी-पीसीआर की तरह बांध परख अत्यधिक संवेदनशील जीन अभिव्यक्ति माप सक्षम, आवश्यक ऊतक homogenization और आरएनए अलगाव vivo कोशिका प्रकार विशिष्टता के नुकसान का संकेत है और रूपात्मक सूचना3. पारंपरिक सीटू आरएनए का पता लगाने के तरीके में ऊतक संदर्भ4के भीतर दुर्लभ या कम-व्यक्त आरएनए के मार्क्स को मज़बूती से मापने के लिए आवश्यक संवेदनशीलता और विशिष्टता की कमी है ।
सीटू संकरण में एक वाणिज्यिक (ISH) परख (जैसे, RNAscope परख) एक तकनीक है कि इन चुनौतियों से निपटने के लिए और भी सक्षम बनाता है एक आरएनए के अति संवेदनशील और विशिष्ट दृश्य ३०० से अधिक अणुओं टिशू रूपात्मक प्रसंग के भीतर न्यूक्लियोटाइड । परख के इस प्रकार के लगभग 6 के एक अद्वितीय oligonucleotide जांच डिजाइन का उपयोग करता है-20 डबल जेड जांच एक उंनत संकरण-आधारित संकेत प्रवर्धन5के साथ संयुक्त जोड़े ।
इस अध्ययन में एक विशेष आरएनए ISH परख, BaseScope, पहले से डिजाइन व्यावसायिक प्रौद्योगिकी है कि एक न्यूक्लियोटाइड संकल्प पर ५० न्यूक्लियोटाइड के रूप में छोटा के रूप में आरएनए लक्ष्य अनुक्रम का पता लगा सकते हैं के पूरक का वर्णन. इस परख transcriptome के जटिल जटिलताओं पते और एक्सॉन जंक्शनों, लघु लक्ष्य दृश्यों, और ऊतक संदर्भ (तालिका 1) में अंक उत्परिवर्तनों का सही पता लगाने के लिए लागू है के रूप में एक डबल जेड जांच जोड़ी के रूप में छोटे का उपयोग कर । इस रिपोर्ट को पूरा परख प्रोटोकॉल और ब्याह वेरिएंट का पता लगाने में इसके उपयोग को दर्शाता है, टी के लिए CDR3 अनुक्रम-सेल रिसेप्टर क्लोन, और एकल-FFPE सेल लाइनों और ट्यूमर के ऊतकों में न्यूक्लियोटाइड उत्परिवर्तनों ।
इस रिपोर्ट में उपन्यास ISH परख प्रोटोकाल और उसके आवेदनों पर विस्तार से चर्चा की गई । परख एक्सॉन जंक्शनों, लघु लक्ष्य और उच्च मुताबिक़ दृश्यों, और ऊतक संदर्भ में बिंदु उत्परिवर्तनों के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है । परख RNAscope प्रौद्योगिकी5 पर आधारित है और इसलिए एकल अणु का पता लगाने में सक्षम है । हालांकि, एक उंनत प्रवर्धन प्रणाली के कारण, संकेत जांच के साथ पता लगाया जा सकता है के रूप में एक डबल जेड जोड़ी के रूप में छोटे या एक लक्ष्य सिर्फ ५० न्यूक्लियोटाइड की लंबाई टेंपलेट के साथ । क्योंकि जांच एक एकल डबल लंबाई में जेड के रूप में के रूप में कम हो सकता है, यह एक्सॉन जंक्शनों, लघु लक्ष्य और उच्च मुताबिक़ दृश्यों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, और बिंदु उत्परिवर्तनों (तालिका 1) ।
परख के सफल प्रदर्शन के लिए, वहां कई तकनीकी सिफारिशें की हैं । सबसे पहले, ऊतकों ताजा 10% तटस्थ में तय किया जाना चाहिए-16 के लिए कमरे के तापमान पर बफर formalin (NBF)-32 एच10। पुनर्निर्धारण ( 32 h) परख के प्रदर्शन को ख़राब करेगा और अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । दूसरा, तापमान और आर्द्रता, जो मजबूत जांच संकरण और संकेत प्रवर्धन के लिए आवश्यक है के इष्टतम नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए, स्लाइड प्रसंस्करण प्रणाली और संकरण ओवन प्रोटोकॉल कदम के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए २.३ 5 (की जरूरत है, जांच को छेड़ो संकरण, संकेत प्रवर्धन, और संकेत पता लगाने) । तीसरे, अतिरिक्त अवशिष्ट बफ़र्स ठीक से प्रोटोकॉल भर में प्रत्येक कदम से पहले नहीं किया जाना चाहिए (लेकिन इतना नहीं है कि ऊतक वर्गों बाहर सूखी) । यदि स्लाइड्स सूख जाती हैं, तो महत्वपूर्ण गैर-विशिष्ट सिग्नल विकसित होंगे । चौथे, ऊतक के प्रकार पर निर्भर करता है, उपचार अनुकूलन आवश्यक हो सकता है । गलत को छेड़ने या समय की एक इष्टतम लंबाई के लिए प्रदर्शन का उपयोग कर के तहत या अधिक पाचन में परिणाम हो सकता है और नकारात्मक संकेत को प्रभावित करेगा । अंत में, यह हमेशा परीक्षण जांच के साथ सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण चलाने के लिए महत्वपूर्ण है । नकारात्मक नियंत्रण जांच सुनिश्चित करें कि कोई पृष्ठभूमि संकेत है, और सकारात्मक नियंत्रण जांच सुनिश्चित करें कि परख सही ढंग से किया गया है और कि नमूना में आरएनए गुणवत्ता परीक्षण जांच परिणामों की व्याख्या के लिए इष्टतम है । यदि सकारात्मक नियंत्रण जांच के साथ कोई संकेत नहीं है, तो नमूना में आरएनए गुणवत्ता की संभावना इष्टतम है और एक संकेत परीक्षण जांच के साथ नहीं देखा जा सकता है ।
मैनुअल परख के अलावा स्वचालित दाग लगाने वालों पर परख कर प्रदर्शन करने की क्षमता (चित्रा 6) का प्रदर्शन भी किया गया । इस स्वचालित ISH परख एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात पैदावार और 1 तालिकामें दिखाया गया है के रूप में एक ही आवेदन के लिए लागू; हालांकि, एक स्वचालित परख के लाभ परख शर्तों के मानकीकरण, अंतर के ंयूनतम उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता और हाथ समय पर, और एक विश्वसनीय तरीके से ऊतक के नमूनों की उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए भत्ता शामिल हैं ।
जबकि immunohistochemistry (आइएचसी) और qRT-पीसीआर ब्याह वेरिएंट का पता लगाने के लिए अनुमति (विशेष रूप से EGFRvIII), FFPE नैदानिक नमूनों में, इन तकनीकों आवश्यक विशिष्टता की कमी है और ब्याह के स्थानिक संकल्प में अंतर्दृष्टि की पेशकश नहीं कर सकते संस्करण अभिव्यक्ति, क्रमशः11,12। इस प्रोटोकॉल में परख का एक महत्वपूर्ण लाभ अपने बेहद संवेदनशील और ब्याह जंक्शनों के विशिष्ट दृश्य है, जबकि रूपात्मक ऊतक संदर्भ के संरक्षण । यहां, परख के लिए ठीक EGFRvIII और METΔ14 सहित कई ब्याह वेरिएंट, के लिए अद्वितीय एक्सॉन जंक्शनों लक्ष्य की क्षमता, (आंकड़े 3 और 6) का प्रदर्शन किया गया । इसके अलावा, परख के ब्याह संस्करण एआर का पता लगाने के लिए दिखाया गया है प्रोस्टेट कैंसर में V7, मस्तिष्क में ErbB4 के कई isoforms, और माउस मस्तिष्क3,13,14में परिपत्र आरएनए Cdr1as की पीटकर की पुष्टि ।
लघु लक्ष्य अनुक्रम का पता लगाने इस ISH परख द्वारा आरएनए दृश्यों के दृश्य के लिए अनुमति देता है के रूप में कम के रूप में ५० न्यूक्लियोटाइड लंबाई में, Jurkat कोशिकाओं से व्युत्पंन CDR3 दृश्यों का पता लगाने के द्वारा प्रदर्शन (चित्रा 3). परख भी जीन दृश्यों कि उच्च अंय परिवार के सदस्यों या प्रजातियों के लिए मुताबिक़ कर रहे है पता लगाने के रूप में Revêchon एट अलद्वारा दिखाया गया है, जो कम लक्ष्य परख इस्तेमाल के लिए मानव progerin का पता लगाने के चमड़े के नीचे सफेद वसा ऊतक में व्यक्त कर सकते है15। इसके अलावा छोटी nucleolar आरएनए (snoRNA), CRISPR-मध्यस्थता जीन एडिटिंग, और कम लक्ष्य की परख के साथ सीटू में प्रणेता-microRNA का पता लगाया जा सकता है । अभी हाल ही में, फू एट अल आइएचसी के साथ इस ISH परख संयुक्त पूर्व miRNA mir125b16व्यक्त रेटिना में सटीक कोशिकाओं की पहचान ।
ट्यूमर में दाखिल उत्परिवर्तन ट्यूमर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए और लक्षित चिकित्सा विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है । जबकि उत्परिवर्तन profiling उच्च प्रवाह अनुक्रमण के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रौद्योगिकी पूरी तरह से intratumoral विविधता या लिंक सेलुलर आकृति विज्ञान17,18के साथ आनुवंशिक परिवर्तन पता नहीं कर सकते । इस ISH परख का उपयोग कर बिंदु उत्परिवर्तनों का पता लगाने के एक एकल आधार संकल्प पर आरएनए लक्ष्य अनुक्रम के भेद के लिए अनुमति देता है, के रूप में EGFR L858R और KRAS G12A एकल न्यूक्लियोटाइड रूपांतरों का पता लगाने के द्वारा मान्य सेल लाइनों में (चित्रा 5). इसके अलावा, बेकर एट अल । बिंदु उत्परिवर्तन परख इस्तेमाल के लिए BRAF, KRAS में कई उत्परिवर्तनों लक्ष्य, और PIK3CA oncogenes कोलोरेक्टल कैंसर18में । वे पहचान करने के लिए और स्थानिक ट्यूमर कोशिकाओं के दुर्लभ उत्परिवर्ती उपक्लोनों नक्शा, अंततः दिखा कैसे वे अंतर ट्यूमर विविधता में योगदान करने में सक्षम थे ।
संक्षेप में, एक विशेष आरएनए ISH परख विकसित किया गया है । यह पद्धति ब्याह वेरिएंट, लघु दृश्यों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, और सीटू मेंउत्परिवर्तनों । यह संवेदनशील है, विशिष्ट, quantifiable, और मैनुअल तरीके से और स्वचालित दाग पर दोनों के प्रदर्शन के लिए अनुकूलनीय ।
The authors have nothing to disclose.
HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) | ACD | 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II) | |
HybEZ Humidity Control Tray (with lid) | ACD | 310012 | |
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 | ACD | 310017 | |
HybEZ Humidifying Paper | ACD | 310015 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required) | Vector Laboratory | H-4000 | |
SuperFrost Plus Slides (required) | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
10% neutral-buffered formalin (NBF) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Paraffin wax | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microtome | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific/MLS | HXGHE1LT | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Xylene | Fisher Scientific/MLS | X3P-1GAL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack | American Master Tech Scientific/MLS | LWSRA24 | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Staining Dishes | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4457EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4456EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
100% alcohol (EtOH) | American Master Tech Scientific/MLS | ALREACS | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
VectaMount Permanent Mounting Medium (required) | Vector Labs | H-5000 | |
Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific/MLS | 12-545-F | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Ammonium hydroxide, 28–30% | Sigma-Aldrich/MLS | 320145-500mL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Carboy (>3L) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer | / | / | |
Digital thermometer | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Pipettors and tips, 1–1000 μL | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Distilled water | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tubes (various sizes) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Fume hood | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Graduated cylinder | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Parafilm | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Paper towel or absorbent paper | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microcentrifuge | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microscope and accessories | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Formaldehyde | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Histogel | Fisher Scientific/MLS | 22-110-678 | |
BaseScope Reagent Kit – RED | Advanced Cell Diagnostics | 322900 | |
BaseScope Hs-EGFR-E1E2 | Advanced Cell Diagnostics | 701701 | |
BaseScope Hs-EGFR-E1E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701711 | |
BaseScope Hs-EGFR-E7E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701721 | |
BaseScope Hs-EGFR-E8E9 | Advanced Cell Diagnostics | 701731 | |
BaseScope Hs-MET-E14E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701811 | |
BaseScope Hs-MET-E13E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701801 | |
BaseScope Hs-KRAS-G12A | Advanced Cell Diagnostics | 705491 | |
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT | Advanced Cell Diagnostics | 705531 | |
BaseScope Hs-EGFR-L858R | Advanced Cell Diagnostics | 705451 | |
BaseScope Hs-EGFR-L858WT | Advanced Cell Diagnostics | 705461 | |
BaseScope Control Probe Pack Human | Advanced Cell Diagnostics | 322975 |