تحليل في المختبر للكشف عن النشاط ترانسفيراز إيسوبينتينيل الحمض الريبي النووي النقال
Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتوصيف البيوكيميائية إنزيم الرنا–تعديل الخميرة، Mod5، ومناقشة كيف يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الإنزيمات الأخرى تعديل الحمض النووي الريبي.
Abstract
ن6-إيسوبينتينيلادينوسيني الحمض النووي الريبي التعديلات متنوعة وظيفيا وحفظت عاليا بين بدائيات النوى وحقيقيات النوى. يحدث أحد أشد المصانة ن6-إيسوبينتينيلادينوسيني التعديلات في A37 بمجموعة فرعية من ترنس. ويحسن هذا التعديل الترجمة الكفاءة والإخلاص بزيادة التقارب من الحمض الريبي النووي النقال الريبوسوم. طفرة إنزيمات المسؤولة عن هذا التعديل في حقيقيات النوى ترتبط مع العديد من الدول المرض، بما في ذلك خلل mitochondrial والسرطان. ولذلك، فهم خصوصية الركيزة والبيوكيميائية أنشطة هذه الإنزيمات مهم لفهم البيولوجيا التوكسينات طبيعية ومرضية. قد استخدمت مجموعة متنوعة من الأساليب لتوصيف أنا التعديلات6A. وهنا يتم وصف نهج مباشر للكشف عن إيسوبينتينيلاتيون من Mod5. ويستخدم هذا الأسلوب الحضانة للكشف مع ترانسفيراز isopentenyl المؤتلف، تليها T1 رناسي الهضم، وتحليل التفريد جل 1-الأبعاد للكشف عن أنا التعديلات6A. وبالإضافة إلى ذلك، يناقش التكيف المحتملة لهذا البروتوكول لتوصيف الإنزيمات الأخرى تعديل الحمض النووي الريبي.
Introduction
وقد حددت 163 على الأقل تعديلات الحمض النووي الريبي بوسترانسكريبشونال متميزة، مع هذه التعديلات إسناد مهام متنوعة وتعتمد على السياق للكشف، والتأثير على بنية الحمض النووي الريبي مباشرة، والتي تؤثر على التفاعلات من الجيش الملكي النيبالي مع الآخر جزيئات1،2. كما يزيد من تقدير لعدد ومتنوعة من الحمض النووي الريبي التعديلات، من الضروري تطوير فحوصات يمكن استجواب موثوق بالتعديلات الجيش الملكي النيبالي والأنزيمات التي تحفيز لهم.
واحدة من أول التعديلات الحمض النووي الريبي تحديد يحدث في قاعدة 37 في ترنس، المتاخمة كودون المضادة على3،4الجانب 3 ‘. يتم نقل مجموعة إيسوبينتينيل من ديميثيلاليلبيروفوسفاتي (دماب) إلى موقف N6 الادينوسين 37 (أنا6A37) 3،5 على مجموعة فرعية ترناس هيولى والميتوكوندريا على حد سواء. أنا6A37 يحسن الترجمة الإخلاص والكفاءة بزيادة تقارب للحمض الريبي النووي النقال الريبوسوم4،6 ، ومن6A37 مهم لإجهاد استجابة في البكتيريا7. الإنزيمات التي تقوم بهذا التعديل يسمى الحمض الريبي النووي النقال إيسوبينتينيل ترانسفيراسيس وهي شديدة المحافظة في البكتيريا8،9والفطريات10،11من الديدان، النباتات12وأعلى حقيقيات النوى13 ، بما في ذلك البشر14.
الطفرات في الإنسان الحمض الريبي النووي النقال إيسوبينتينيل ترانسفيراز الجينات، TRIT1، المرتبطة بالأمراض التي تصيب البشر. على سبيل المثال، يرتبط بطفرة في TRIT1 مع مرض المتقدرية شديدة، ناجمة على الأرجح عن خلل في البروتين المتقدرية توليف15،16. وعلاوة على ذلك، وصفت بأنها ورم المكثف جينات17،18 TRIT1 وتورط في عدة أنواع من السرطان بما في ذلك سرطان الجلد19،20من الثدي و المعدة21وسرطانات الرئة22 ،23. وأخيراً، TRIT1 و Mod5 ترانسفيراسيس إيسوبينتينيل (Saccharomyces cerevisiae) هي المعرضة لتجميع البروتينات التي تشكل ألياف اميلويد مثل بريون24،،من2526. يحتمل أن تكون هذه الملاحظات توريط الحمض الريبي النووي النقال إيسوبينتينيل ترانسفيراسيس في أمراض الأعصاب، على الرغم من أن الأدلة المباشرة لهذا لم تظهر بعد.
نظراً للدور الذي تؤديه ترانسفيراسيس إيسوبينتينيل في الترجمة، والمرض، وأساليب مباشرة قياس مدى6نشاطا ترانسفيراز إيسوبينتينيل هي هامة لفهم ميكانيكية لهذه الإنزيمات تحت العادي والحالات المرضية. عدد متزايد من أساليب متوفرة للكشف عن أنا6“الجيش الملكي النيبالي” التعديلات، بما في ذلك في المختبر فحوصات إيسوبينتينيلاتيون، التهجين إيجابية في غياب أنا رقيقة6فحوصات (PHA6)، طبقة اللوني (TLC)، الأحماض الأمينية قبول النشاط فحوصات، والنهج الكتلي (المراجعة في الرقم 4).
لقد وصفت الإنزيم إيسوبينتينيليشن في المختبر يستخدم 14ج-DMAPP وترنس غير مسمى. في هذا التحليل، يتم نقل الكربون المشعة للجيش الملكي النيبالي من 14ج-دماب من ترانسفيراز إيسوبينتينيل. أثناء هذا الفحص حساس بدرجة كبيرة، من الصعب غالباً تحديد بقايا المحددة التي يتم تعديل9،،من2027. فحوصات PHA6 تعتمد على ضخمة أنا التعديل6بالتدخل مع التهجين التحقيق المسمى ف 32تمتد بقايا تم التعديل. على هذا النحو، أكبر في غياب أنا التهجين6تعديل18،،من2829. فحوصات PHA6 حساسة للغاية، وقادرة على تحليل الحمض النووي الريبي الإجمالية المستخرجة من ليساتيس الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، يعطي القدرة على تصميم المجسات الخاصة بالجيش الملكي النيبالي لمصلحة هذه المرونة هدفا كبيرا في الأسلوب. ومع ذلك، تقتصر فحوصات PHA6 وصف التعديلات التي تحدث على بقايا داخل المنطقة المستهدفة من التحقيق وذلك هي أقل احتمالاً لتحديد مواقع تعديل رواية. وباﻹضافة إلى ذلك، كما غياب الربط إرشادي للتعديل، التعديلات أو الطفرات التي تؤثر على الحمض النووي الريبي ملزمة أخرى سوف يتيه تحليل البيانات.
نهج آخر يجمع البنزيل دي السليلوز (دينار بحريني) السليلوز اللوني مع الأحماض الأمينية قبول النشاط كقراءات أنا التعديلات6A في الحمض الريبي النووي النقال30. هذا النهج مباشرة فحوصات الوظيفة أنا التعديل6A، ولكن هو نهج غير مباشرة للكشف عن أنا التعديل6A ويفتقر إلى قرار لتعيين إدخال تعديلات على رواسب محددة في الجيش الملكي النيبالي. وقد استخدمت نهج TLC للكشف عن مجموع الحمض الريبي النووي النقال أنا التعديلات6A. في هذا النهج، داخليا يتم هضمها 32ترنس المسمى ف إلى النيوكليوتيدات واحدة ويستخدم ثنائي الأبعاد TLC التحليل لتحديد إيسوبينتينيليشن. وهذا النهج حساسة للغاية في الكشف عن مجموع أولاً6A في عينة الحمض النووي الريبي معين ولكن عند الهضم، كل تسلسل المعلومات المفقودة؛ وهكذا، المحقق على أي طريقة من تحديد أي بقايا تم تعديل31.
في الآونة الأخيرة، أساليب السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS) قد وضعت الكمية مقارنة مجموع التعديلات الحمض النووي الريبي بين الأنواع، أنواع الخلايا، وظروف تجريبية32،33، 34. حد من هذه المنهجية هو أنها أقل قدرة على تحديد هوية والموقف داخل الجيش الملكي النيبالي الذي كان نوكليوزيد المعدلة المستمدة34. وعلاوة على ذلك، بالخبرة الفنية والمعدات اللازمة لتنفيذ هذه التجارب تحد من إمكانية التطبيق العملي لهذا النهج.
وباﻹضافة إلى ذلك، وضعت العديد من تقنيات الجيل التالي التسلسل لخريطة الحمض النووي الريبي تعديلات على نطاق الترنسكربيتوم34. إيمونوبريسيبيتيشن من الكشف مع الأجسام المضادة المحددة لتعديل معين (RIP-Seq) تمكين المحقق لتحديد تسلسل كل تحتوي على35،تعديل محددة36. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد النهج المستندة إلى المنتسخة العكسية مثل Seq تشيم وتسلسل عدم تطابق غير عشوائية على الاضطرابات من رد فعل النسخ العكسي في38،،من37بقايا تم التعديل39. على الرغم من الاستفادة من هذه التقنيات خريطة الحمض النووي الريبي التعديلات الترنسكربيتوم المنظومة، seq التمزق وتكنولوجيات Seq تشيم مقيدة بعدم وجود الأجسام المضادة موثوق بها أو المواد الكيميائية المتفاعلة متاحة لكل تعديل محددة، على التوالي34. وعلاوة على ذلك، الإنزيمات المنتسخة العكسية المطلوبة لأداء Seq تشيم وعدم تطابق غير عشوائية يسلسل تقنيات يمكن أن يعوقها هياكل الحمض النووي الريبي مستقرة. تعديل للغاية ومستقر هيكلياً طبيعة ترنس جعلها صعبة للغاية استجواب باستخدام هذه التقنيات. وحتى الآن، تقنيات الجيل القادم على أساس التسلسل قد لم تستخدم للخريطة الأول6تعديلات34.
هنا، يمكننا وصف نهج بسيط ومباشر للكشف عن أنا6A الحمض الريبي النووي النقال التعديلات في المختبر. ويستخدم هذا الأسلوب الحضانة للكشف مع المؤتلف S. cerevisiae إيسوبينتينيل ترانسفيراز (Mod5)، تليها T1 رناسي الهضم، وتحليل التفريد جل 1-الأبعاد الخريطة الأول6بالتعديلات. هذا النهج المباشر ويتطلب خبرة متخصصة قليلاً لتحليل البيانات. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب قابلة للتكيف للحمض النووي الريبي الأخرى تعديل الإنزيمات، بما فيها الإنزيمات التي تساهمي تغيير الوزن الجزيئي للحمض النووي الريبي أو التنقل رنا عبر هلام.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا تزال التعديلات الحمض النووي الريبي سيظهر على القيام بأدوار هامة ومتنوعة أكثر من أي وقت مضى في وظيفة الخلوية والعضوي. على هذا النحو، تطوير فحوصات استجواب رنا تعديل الإنزيمات المركزية لتحسين فهم الجوانب الأساسية لعلم الأحياء. ويصف هذا البروتوكول مقايسة عالية الدقة في المختبر تميز ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتور ديفيد انجيلكي لقيادته وتعليقات مفيدة على هذه المخطوطة. نقابة الصحفيين الفلسطينيين-جامعة الدولة الكرة مختبر أموال بدء التشغيل؛ الدأب-منح 1R15AI130950-01.
Materials
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).
- Soll, D. Enzymatic modification of transfer RNA. Science. 173 (3994), 293-299 (1971).
- Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).
- Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).
- Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).
- Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22 (5), 729-742 (2016).
- Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. 생화학. 39 (21), 6546-6553 (2000).
- Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).
- Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. 유전학. 159 (1), 147-157 (2001).
- Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).
- Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).
- Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).
- Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).
- Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).
- Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556 (1), 13-18 (2015).
- Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).
- Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3′ untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
- Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).
- Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).
- Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).
- Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients’ survival. Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).
- Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).
- Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. 생화학. 40 (6), 1734-1740 (2001).
- Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).
- Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).
- Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).
- Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18 (1), 11-26 (1979).
- Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).
- Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
- Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3′ UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159 (1), 148-162 (2014).
- Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).
- Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).
