Un test In Vitro pour détecter l’activité ARNt-isopentényl transférase
Summary
Nous décrivons ici un protocole pour la caractérisation biochimique de l’enzyme de RNA-modification de la levure, Mod5 et discuter de comment ce protocole pourrait être appliqué à d’autres enzymes de modification des RNA.
Abstract
Modifications de N6– isopentényl RNA sont fonctionnellement variées et hautement conservée chez les procaryotes et les eucaryotes. Une des plus hautement conservée N6– isopentényl modifications se produit à la position de A37 dans un sous-ensemble des ARNt. Cette modification améliore l’efficacité de la traduction et de la fidélité en augmentant l’affinité de l’ARNt pour le ribosome. Mutation des enzymes responsables de cette modification chez les eucaryotes sont associées à plusieurs états pathologiques, dont le cancer et dysfonctionnement mitochondrial. Par conséquent, comprendre la spécificité de substrat et l’activité biochimique de ces enzymes est important pour la compréhension de la biologie eucaryote normale et pathologique. Un large éventail de méthodes a été utilisé pour caractériser les modifications6A je. Dans les présentes est décrit une approche directe pour la détection des isopentenylation par Mod5. Cette méthode utilise l’incubation d’ARN avec une transférase isopentényl recombinante, suivie de la digestion de RNase T1 et l’analyse par électrophorèse sur gel 1D pour détecter les modifications de6A je. En outre, la capacité d’adaptation éventuelle du présent protocole pour caractériser d’autres enzymes de modification des RNA est discutée.
Introduction
Au moins 163 modifications de RNA post-transcriptionnel distinctes ont été identifiées, avec ces modifications conférant des fonctions variées et contextuelle à RNAs, directement influencer la structure d’ARN et qui touchent de l’ARN, des interactions avec d’autres molécules1,2. Que l’appréciation par le nombre et la variété de modifications de RNA augmente, il est essentiel d’élaborer des tests qui peuvent interroger fiable tant les modifications de RNA et les enzymes qui catalysent les.
Une des premières modifications RNA d’identifier se produit à base 37 dans les ARNt, adjacent à l’anti-codon sur les 3′ côté3,4. Un groupe d’isopentényl est transféré de diméthylallylpyrophosphate (DMAPP) sur la position N6 d’adénosine 37 (j’ai6A37) 3,5 sur un sous-ensemble des ARNt cytoplasmiques et mitochondriale. J’ai6A37 améliore la fidélité de la traduction et l’efficacité en augmentant d’affinité de l’ARNt pour le ribosome4,6 et j’ai6A37 est importante pour la réponse au stress en bactéries7. Les enzymes qui effectuent cette modification sont appelés transférases isopentényl tRNA et sont hautement conservées chez les bactéries8,9, champignons10, vers11, plantes12et chez les eucaryotes supérieurs13 , y compris les humains,14.
Des mutations dans le gène humain de transférase isopentenyl de tRNA, TRIT1, sont associées à des maladies humaines. Par exemple, une mutation dans TRIT1 est corrélée avec une grave maladie mitochondriale, probablement causée par un défaut de synthèse de protéines mitochondriales15,16. Par ailleurs, TRIT1 a été décrit comme un suppresseur de tumeur gène17,18 et est impliquée dans plusieurs types de cancers dont le mélanome19, poitrine20, gastrique21et cancers du poumon22 ,,23. Enfin, TRIT1 et Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentényl transférase est sujettes à l’agrégation de protéines qui forment prion comme fibres amyloïdes24,25,26. Ces observations impliquent potentiellement transférases isopentényl tRNA dans les maladies neurodégénératives, même si une preuve directe pour que cela n’a pas encore été démontrée.
Compte tenu du rôle qu’isopentényl transférase joue dans la traduction et la maladie, les méthodes que j’ai mesurer directement6une activité d’isopentényl transférase sont importants pour une interprétation mécaniste de ces enzymes dans des conditions normales et états pathologiques. Un nombre croissant de méthodes est disponible pour détecter les adaptations de l’ARN de6, y compris en vitro isopentenylation essais, hybridation j’ai en l’absence d’i6A (PHA6) essais, mince chromatographie en couche (TLC), acides aminés tests d’activité acceptation et approches de la spectrométrie de masse (révision Réf. 4).
Une essai in vitro isopentenylation avec a été décrit qui utilise 14C-DMAPP et ARNt sans étiquette. Dans ce test, le carbone radioactif est transféré à l’ARN du 14C-DMAPP de l’isopentényl transférase. Bien que ce test est très sensible, il est souvent difficile de déterminer le résidu spécifique qui est modification9,20,27. PHA6 analyses reposent sur l’encombrant j’ai6A modification interférant avec l’hybridation d’une sonde marquée P 32, s’étendant sur le résidu mis à jour le. À ce titre, l’hybridation est plus grande en l’absence d’un i6une modification18,28,29. Les dosages de PHA6 sont très sensibles et capable d’analyser l’ARN total extrait de lysats cellulaires. En outre, la capacité de concevoir des sondes spécifiques de l’ARN d’intérêt permet cette méthode cible importante. Cependant, PHA6 tests sont limités à la caractérisation des modifications qui se produisent sur les résidus dans la région ciblée de la sonde et sont donc moins susceptibles d’identifier les sites de nouvelles modifications. En outre, comme l’absence de liaison est révélateur de la modification, autres modifications ou mutations qui affectent les ARN contraignantes confondre l’analyse des données.
Une autre approche combine chromatographie de cellulose de benzyle DEAE cellulose (BD) avec activité acceptation d’acides aminés comme une lecture de je6A des modifications dans le tRNA30. Cette approche tests directement la fonction du i modification6A, mais c’est une approche indirecte pour détecter j’ai6A modification et n’a pas de résolution pour mapper les modifications apportées à un résidu spécifique dans l’ARN. Une approche de TLC a été utilisée pour détecter les ARNt total j’ai6A modifications. Dans cette approche, en interne, 32P-étiqueté ARNt sont digérées en nucléotides simples et analyse bidimensionnelle de TLC est utilisé pour identifier des isopentenylation. Cette approche est très sensible dans la détection j’ai total6A dans un échantillon donné de RNA mais après digestion, toutes les informations de séquence sont perdues ; ainsi, le chercheur n’a aucun moyen de déterminer les résidus ont été mis à jour le31.
Plus récemment, les méthodes de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS) ont été développés qui comparer quantitativement les modifications de RNA totales entre espèces, les types de cellules et conditions expérimentales32,33, 34. Une limitation de cette méthodologie est qu’il est moins en mesure de déterminer l’identité et la position au sein de l’ARN d’où le nucléoside modifié a été dérivé de34. De plus, l’expertise et l’équipement nécessaire pour exécuter ces expériences limitent l’aspect pratique de cette approche.
En outre, plusieurs technologies de séquençage de nouvelle génération ont été développés pour mapper les RNA modifications à l’échelle du transcriptome34. Immunoprécipitation d’ARN avec des anticorps spécifiques à une modification particulière (RIP-Seq) permettent à l’enquêteur d’identifier toutes les séquences contenant une modification spécifique35,36. En outre, approches axées sur la transcriptase inverse comme Chem-Seq et séquençage de décalage non aléatoire s’appuient sur les perturbations de la réaction de transcription inverse les résidus modifiés37,38,39. Malgré l’avantage de ces techniques pour mapper les modifications transcriptome-échelle de RNA, RIP-seq et Seq-Chem technologies sont limités par l’absence d’anticorps fiables ou de produits chimiques réactifs disponibles pour chaque modification spécifique, respectivement34. En outre, reverse transcriptase enzymes nécessaires à l’exécution de Chem-Seq et les techniques de séquençage de décalage non aléatoire peuvent être entravés par des structures d’ARN stables. Le caractère fortement modifié et structurellement stable des ARNt rendent particulièrement difficiles à interroger à l’aide de ces techniques. A ce jour, la nouvelle génération basée sur le séquençage des technologies n’ont pas encore été utilisés à carte j’ai6une modification34.
Ici, les auteurs décrivent une approche simple et directe pour détecter j’ai6un ARNt modifications in vitro. Cette méthode utilise l’incubation d’ARN avec recombinant S. cerevisiae isopentényl transférase (Mod5), suivie de la digestion de la RNase T1 et analyse par électrophorèse sur gel 1D à la carte j’ai6A modifications. Cette approche est directe et nécessite peu d’expertise pour analyser les données. En outre, cette méthode est adaptable aux autre RNA modification des enzymes, y compris les enzymes qui changent par covalence le poids moléculaire de l’ARN ou de mobilité d’un ARN à travers un gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifications de RNA continuent de figurer à jouer un rôle toujours plus important et diversifié dans la fonction cellulaire et organismique. Ainsi, le développement des tests d’interroger RNA modification des enzymes est central pour mieux comprendre les aspects fondamentaux de la biologie. Ce protocole décrit une analyse haute résolution in vitro afin de caractériser l’activité de modification tRNA de Mod5.
Ce protocole a l’avantage d’offrir une lecture directe et fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr. David Engelke pour ses conseils et commentaires utiles sur ce manuscrit. PJS – des fonds de démarrage de laboratoire de Ball State University ; DAB – accorder 1R15AI130950-01.
Materials
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
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