Een In Vitro Assay tRNA-Isopentenyl Transferase activiteit detecteren
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor de Biochemische karakterisering van de gist RNA-aanpassen enzym, Mod5, en bespreken hoe dit protocol kan worden toegepast op andere RNA-aanpassen-enzymen.
Abstract
N6– isopentenyladenosine RNA wijzigingen zijn functioneel divers en hoogst geconserveerde onder de prokaryoten en de eukaryoten. Een van de hoogst geconserveerde N6– isopentenyladenosine wijzigingen plaatsvindt aan de A37 positie in een subset van tRNAs. Deze wijziging verbetert vertaling efficiëntie en trouw doordat de affiniteit van het tRNA van het ribosoom. Mutatie van enzymen die verantwoordelijk zijn voor deze wijziging in eukaryoten zijn geassocieerd met verschillende staten van de ziekte, met inbegrip van mitochondriale dysfunctie en kanker. Daarom is het belangrijk voor begrip van de normale en pathologische eukaryotische biologie inzicht in de specificiteit van het substraat en biochemische activiteiten van deze enzymen. Veelzijdige methoden heeft tewerkgesteld te karakteriseren ik6A wijzigingen. Hierin is beschreven van een directe aanpak voor het opsporen van isopentenylation door Mod5. Deze methode maakt gebruik van incubatie van RNAs met een recombinant isopentenyl transferase, gevolgd door RNase T1 spijsvertering, en 1-dimensionale gel elektroforese analyse te detecteren ik6A wijzigingen. Bovendien, wordt het potentiële aanpassingsvermogen van dit protocol te karakteriseren van andere RNA-aanpassen-enzymen besproken.
Introduction
Ten minste 163 verschillende posttranscriptional RNA wijzigingen zijn geïdentificeerd, met deze wijzigingen verlenen divers en context-afhankelijke functies aan RNAs direct RNA structuur te beïnvloeden en op het gebied van interacties van RNA met andere moleculen1,2. Naarmate de waardering voor het aantal en de verscheidenheid van RNA wijzigingen toeneemt, is het essentieel om te testen dat betrouwbaar ondervragen kunnen zowel de RNA-wijzigingen en de enzymen die hen katalyseren ontwikkelen.
Een van de eerste wijzigingen van het RNA kan worden geïdentificeerd optreedt bij base 37 in tRNAs, grenzend aan de anti-codon op de 3′ kant3,4. Een groep isopentenyl wordt overgedragen van dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) naar de positie van de N6 van adenosine 37 (ik6A37) 3,,5 op een subset van zowel de cytoplasmatische en de mitochondriale tRNAs. Ik6A37 verbetert vertaling trouw en efficiëntie door het verhogen van het tRNA affiniteit voor het ribosoom4,6 en ik6A37 is belangrijk voor de stressrespons bij bacteriën7. De enzymen die het uitvoeren van deze wijziging tRNA isopentenyl enzym worden genoemd en zijn zeer geconserveerd in bacteriën8,9, schimmels10wormen11, planten12en hogere eukaryoten13 , met inbegrip van mensen14.
Mutaties in het menselijk tRNA isopentenyl transferase gen, TRIT1, worden geassocieerd met ziekten bij de mens. Bijvoorbeeld, is een mutatie in TRIT1 gecorreleerd met een ernstige Mitochondriale ziekte, waarschijnlijk veroorzaakt door een defect in de mitochondriële eiwit synthese15,16. Verder TRIT1 is beschreven als een tumor suppressor gen17,18 en is betrokken bij verschillende soorten kanker, met inbegrip van melanoom19, borst20, maag21en longkankerziekten22 ,23. Tot slot, TRIT1 en Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl enzym zijn aggregatie-naar voren gebogen eiwitten die prion-achtige amyloïde vezels24,25,26 vormen. Deze opmerkingen betrekken mogelijk tRNA isopentenyl enzym in neurodegeneratieve ziekten, hoewel directe bewijs hiervoor is nog niet aangetoond.
Gezien de rol van dat isopentenyl enzym in vertaling en ziekte, methoden die direct meten ik6een isopentenyl transferase activiteit zijn belangrijk voor een mechanistische begrip van deze enzymen onder normale en ziekte staten. Een toenemend aantal methoden zijn beschikbaar om te detecteren ik6A RNA wijzigingen, met inbegrip van in vitro isopentenylation testen, positieve kruising bij gebrek aan ik6een (PHA6) testen, dunne laag chromatografie (TLC), amino acid aanvaarding activiteit testen en massaspectrometrie benaderingen (herzien in Ref. 4).
Een isopentenylation in vitro assay is beschreven dat gebruik maakt van de 14C-DMAPP en labelloze tRNAs. In deze test, wordt radioactieve koolstof overgebracht naar RNA van 14C-DMAPP door de isopentenyl transferase. Terwijl deze test zeer gevoelig is, is het vaak moeilijk om te bepalen de specifieke residu dat is gewijzigd9,20,27. PHA6 testen zijn afhankelijk van de omvangrijke ik6A wijziging kruising van een 32P-geëtiketteerden sonde verspreid over het gewijzigde residu verstoren. Als zodanig, hybridisatie is groter bij gebrek aan een i6een wijziging18,28,29. PHA6 testen zijn zeer gevoelig, en staat totaal RNA cellulaire lysates is onttrokken te analyseren. Bovendien geeft de mogelijkheid om het ontwerp van de sondes die specifiek zijn voor het RNA van belang deze methode aanzienlijke doel flexibiliteit. PHA6 tests zijn echter beperkt tot de karakterisering van de wijzigingen die optreden inzake residuen in het gerichte gebied van de sonde en zijn dus minder kans op identificatie van nieuwe wijziging sites. Bovendien, zoals gebrek aan bindende is een indicatie van de wijziging, zal andere wijzigingen of mutaties die invloed hebben op RNA-bindende verwarren gegevensanalyse.
Een andere benadering combineert benzyl DEAE cellulose (BD) cellulose chromatografie met aminozuur aanvaarding activiteit als een uitlezing van ik6A wijzigingen in tRNA30. Deze aanpak testen direct de functie van de i6A wijziging, maar het is een indirecte benadering te detecteren ik6A wijziging en mist resolutie om wijzigingen aan een specifiek residu in het RNA in kaart. Een TLC-aanpak is gebruikt voor het detecteren van totale tRNA ik6A wijzigingen. In deze benadering intern 32P-label tRNAs naar één nucleotiden worden verteerd en tweedimensionale TLC-analyse wordt gebruikt ter identificatie van de isopentenylation. Deze benadering is zeer gevoelig voor het opsporen van total ik6A in een RNA monster maar op de spijsvertering, alle opeenvolgingsinformatie verloren; de onderzoeker heeft dus geen enkele manier om te bepalen welke residuen geweest gewijzigde31.
Meer recentelijk, vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) methoden hebben ontwikkeld die kwantitatief vergelijk totale RNA wijzigingen tussen soorten, celtypes en proefomstandigheden32,33, 34. Een beperking van deze methode is dat het minder goed in staat om de identiteit en positie binnen het RNA waaruit de gemodificeerde nucleoside was afgeleid34. Bovendien, de deskundigheid en apparatuur die nodig is voor het uitvoeren van deze experimenten beperken de bruikbaarheid van deze aanpak.
Daarnaast zijn verschillende technologieën van de volgende generatie sequencing ontwikkeld om te kaart RNA wijzigingen transcriptome bestrijkende34. Immunoprecipitation van RNAs met antilichamen specifiek voor een bepaalde wijziging (RIP-Seq) kunnen de onderzoeker te identificeren alle sequenties met een specifieke wijziging35,36. Reverse-transcriptase-gebaseerde benaderingen zoals Chem-Seq en niet-random mismatch sequencing is bovendien afhankelijk van verstoringen van de omgekeerde transcriptie reactie op de gewijzigde residuen37,38,39. Ondanks het voordeel van deze technieken om de kaart van RNA wijzigingen transcriptome bestrijkende, worden RIP-seq en Chem-Seq technologieën beperkt door het gebrek aan betrouwbare antilichamen of reactieve chemicaliën beschikbaar voor elke specifieke modificatie, respectievelijk34. Bovendien, reverse-transcriptase enzymen moeten uitvoeren Chem-Seq en niet-random mismatch sequencing technieken kunnen worden belemmerd door stabiele RNA structuren. De sterk gewijzigde en structureel stabiele aard van tRNAs maken hen bijzonder moeilijk te ondervragen met behulp van deze technieken. Tot op heden, hebben next-generation sequencing gebaseerde technologieën niet nog is gebruikt om kaart ik6een wijzigingen-34.
Hierin beschrijven we een eenvoudige en directe aanpak om te detecteren ik6A tRNA wijzigingen in vitro. Deze methode maakt gebruik van incubatie van RNAs met recombinant S. cerevisiae isopentenyl transferase (Mod5), gevolgd door RNase T1 spijsvertering, en 1-dimensionale gel elektroforese analyse ik6A wijzigingen in kaart. Deze aanpak is direct en vereist weinig gespecialiseerde expertise om de gegevens te analyseren. Bovendien is deze methode kan worden aangepast aan andere RNA wijzigen van enzymen, met inbegrip van enzymen die covalent het molecuulgewicht van RNA of een RNA van mobiliteit door een gel veranderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA wijzigingen blijven aan steeds meer belangrijke en gevarieerde rol spelen in de cellulaire en organisch functie getoond. Als zodanig, staat de ontwikkeling van tests te ondervragen van RNA wijzigen enzymen centraal in het meer inzicht te krijgen in de fundamentele aspecten van de biologie. Dit protocol beschrijft een hoge resolutie in vitro assay karakteriseren de tRNA wijziging activiteit van Mod5.
Dit protocol heeft het duidelijk voordeel van het verstrekken van een directe, en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij wil Dr. David Engelke bedanken voor zijn begeleiding en nuttige opmerkingen op dit manuscript. PJS – Ball State University laboratorium opstarten middelen; SCHAR – 1R15AI130950-01 verlenen.
Materials
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).
- Soll, D. Enzymatic modification of transfer RNA. Science. 173 (3994), 293-299 (1971).
- Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).
- Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).
- Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).
- Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22 (5), 729-742 (2016).
- Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. 생화학. 39 (21), 6546-6553 (2000).
- Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).
- Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. 유전학. 159 (1), 147-157 (2001).
- Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).
- Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).
- Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).
- Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).
- Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).
- Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556 (1), 13-18 (2015).
- Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).
- Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3′ untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
- Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).
- Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).
- Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).
- Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients’ survival. Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).
- Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).
- Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. 생화학. 40 (6), 1734-1740 (2001).
- Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).
- Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).
- Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).
- Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18 (1), 11-26 (1979).
- Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).
- Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
- Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3′ UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159 (1), 148-162 (2014).
- Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).
- Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).
