En In Vitro Assay at opdage tRNA-Isopentenyl-Transferase aktivitet
Summary
Her, vi beskriver en protokol for den biokemiske karakterisering af gær RNA-ændring enzym, Mod5, og diskutere hvordan denne protokol kan anvendes til andre RNA-ændring enzymer.
Abstract
N6– isopentenyladenosine RNA modifikationer er funktionelt mangfoldigt og meget velbevarede blandt prokaryoter og eukaryoter. En af de mest velbevarede N6– isopentenyladenosine ændringer sker på A37 position i en delmængde af tRNAer. Denne ændring forbedrer oversættelse effektivitet og troskab ved at øge affinitet af tRNA til ribosomet. Mutation af enzymer ansvarlig for denne ændring i eukaryoter er forbundet med adskillige sygdomstilstande, herunder mitokondriel dysfunktion og kræft. Derfor forståelse substrat specificitet og biokemiske aktiviteter af disse enzymer er vigtigt til forståelse af normale og patologiske eukaryote biologi. En alsidig vifte af metoder er blevet ansat til at karakterisere jeg6A ændringer. Heri er beskrevet en direkte tilgang til påvisning af isopentenylation af Mod5. Denne metode udnytter inkubation af RNA’er med en rekombinante isopentenyl transferase, efterfulgt af RNase T1 fordøjelsen, og 1-dimensional gel elektroforese analyse at opdage jeg6A ændringer. Derudover diskuteres den potentielle tilpasningsevne af denne protokol til at karakterisere andre RNA-ændring enzymer.
Introduction
Mindst 163 særskilte posttranskriptionelle RNA modifikationer er blevet identificeret, med disse ændringer giver forskellige og kontekst-afhængige funktioner til RNA’er, direkte påvirke RNA struktur, og som påvirker RNA interaktioner med andre molekyler1,2. Som påskønnelse for antal og udvalg af RNA modifikationer øger, er det afgørende at udvikle assays, der kan pålideligt afhøre både RNA modifikationer og de enzymer, der katalyserer dem.
En af de første RNA modifikationer kan identificeres opstår på base 37 i tRNAer, støder op til anti-codon på 3′ side3,4. En isopentenyl gruppe er overført fra dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) til N6 placeringen af adenosin 37 (jeg6A37) 3,5 på en delmængde af cytoplasmatisk og mitokondriel tRNAer. Jeg6A37 forbedrer translation fidelity og effektivitet ved at øge den tRNA affinitet for ribosomet4,6 og6A37 er vigtigt for stressrespons i bakterier7. De enzymer, der udfører denne ændring kaldes tRNA isopentenyl transferaser og er meget bevaret i bakterier8,9, svampe10, orme11, planter12og højere eukaryoter13 , herunder mennesker14.
Mutationer i menneskelige tRNA isopentenyl-transferase-genet, TRIT1, er forbundet med sygdom hos mennesker. For eksempel, er en mutation i TRIT1 korreleret med en svær mitokondrie sygdom, sandsynligvis forårsaget af en defekt i mitokondrie protein syntese15,16. Derudover TRIT1 er blevet beskrevet som en tumor suppressor genet17,18 og er involveret i flere typer af kræft, herunder melanom19, bryst20, gastrisk21og lungekræft22 ,23. Endelig, TRIT1 og Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl transferaser er sammenlægning-tilbøjelige proteiner, der danner prion-lignende amyloid fibre24,25,26. Disse observationer indblande potentielt tRNA isopentenyl transferaser i neurodegenerative sygdomme, selvom direkte beviser for dette endnu ikke er blevet vist.
I betragtning af den rolle at isopentenyl transferaser spiller i oversættelse og sygdom, metoder, som direkte måler jeg6en isopentenyl transferase aktivitet er vigtigt for en mekanistisk forståelse af disse enzymer under normal og sygdomstilstande. Et stigende antal metoder er tilgængelige til at opdage jeg6A RNA modifikationer, herunder in vitro- isopentenylation-assays positive hybridisering i mangel af jeg6-undersøgelser, som en (PHA6), tynde lag kromatografi (TLC), aminosyre accept aktivitet assays og massespektrometri tilgange (anmeldt i Ref. 4).
En in vitro- isopentenylation analyse er blevet beskrevet som udnytter 14C-DMAPP og umærkede tRNAer. I denne analyse, er radioaktivt kulstof overført til RNA fra 14C-DMAPP af isopentenyl-transferase. Denne analyse er meget følsomme, men det er ofte vanskeligt at bestemme den specifikke rest, som er modificeret9,20,27. PHA6 assays stole på den voluminøse6A ændring forstyrrer hybridisering af en 32P-mærket sonde der spænder over de ændrede restkoncentrationer. Hybridisering er således større i mangel af en jeg6en ændring18,28,29. PHA6 assays er meget følsomme, og i stand til at analysere total RNA ekstraheret fra cellulære lysates. Derudover giver mulighed for at designe sonder specifikke til RNA af interesse denne metode væsentlige mål fleksibilitet. PHA6 assays er dog begrænset til karakterisering af ændringer, der forekommer på rester i den målrettede region af sonden og derfor er mindre tilbøjelige til at identificere websteder, Roman ændring. Desuden, mangel af bindende er betegnende for ændring, vil andre ændringer eller mutationer, der påvirker RNA bindende forvirre dataanalyse.
En anden tilgang kombinerer benzyl DEAE cellulose (BD) cellulose kromatografi med aminosyren accept aktivitet som en udlæsning af jeg6A ændringer i tRNA30. Denne fremgangsmåde direkte undersøgelser vedrørende funktionen af jeg6A ændring, men det er en indirekte tilgang til opdage jeg6A ændring og mangler beslutning at kortlægge ændringer til en specifik rester i RNA. Et TLC tilgang har været brugt til at registrere samlede tRNA jeg6A ændringer. I denne tilgang, internt 32P-mærket tRNAer er fordøjet til enkelt nukleotider og todimensional TLC analyse bruges til at identificere isopentenylation. Denne tilgang er meget følsom til at opdage alt jeg6A i en given RNA prøve men på fordøjelsen, alle sekvens oplysninger går tabt; således har investigator ingen måde at afgøre hvilke rester er blevet ændret31.
Mere nylig, liquid chromatography-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) metoder er blevet udviklet som kvantitativt sammenligner total RNA modifikationer mellem arter, celletyper og forsøgsbetingelser32,33, 34. En begrænsning af denne metode er, at det er mindre i stand til at bestemme identiteten og position inden for RNA som den modificerede nucleoside blev afledt34. Desuden begrænse den ekspertise og de nødvendige udstyr til at udføre disse eksperimenter den praktiske gennemførlighed af denne fremgangsmåde.
Derudover er flere næste generation sequencing teknologier blevet udviklet for at kortlægge RNA modifikationer transkriptom-dækkende34. Immunoprecipitation af RNA’er med antistoffer specifikke for en bestemt ændring (RIP-Seq) aktiverer investigator at identificere alle sekvenser som indeholder en bestemt ændring35,36. Derudover stole reverse transkriptase-baserede tilgange såsom Chem-FF. og ikke-tilfældige uoverensstemmelse sekventering på perturbationer reverse transkription reaktion på de ændrede restkoncentrationer37,38,39. Trods fordelen af disse teknikker til at kortlægge RNA modifikationer transkriptom-wide, er RIP-seq og Chem-Seq teknologier begrænset af manglen pålidelige antistoffer eller reaktive kemikalier tilgængelig for hver specifik ændring, henholdsvis34. Derudover reverse transkriptase enzymer kræves for at udføre Chem-FF. og ikke-tilfældige uoverensstemmelse sekventering teknikker kan hindres af stabile RNA strukturer. TRNAer stærkt modificerede og strukturelt stabil karakter gør dem særlig vanskeligt at afhøre ved hjælp af disse teknikker. Til dato, har næste generation sequencing-baserede teknologier ikke endnu blevet udnyttet til kort i6en ændringer34.
Heri, beskriver vi en enkel og direkte tilgang til at opdage jeg6A tRNA ændringer in vitro. Denne metode udnytter inkubation af RNA’er med rekombinant S. cerevisiae isopentenyl transferase (Mod5), efterfulgt af RNase T1 fordøjelsen, og 1-dimensional gel elektroforese analyse til kort i6A ændringer. Denne tilgang er direkte og kræver lidt specialiseret ekspertise til at analysere dataene. Denne metode er desuden kan tilpasses til andre RNA ændre enzymer, herunder enzymer, der kovalent ændrer molekylvægt af RNA eller en RNA mobilitet gennem en gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA modifikationer fortsat vist at spille mere og mere vigtige og forskelligartede roller i cellulært og kropsligt funktion. Som sådan, er udvikling af assays til at afhøre RNA ændre enzymer centralt for bedre forståelse af de grundlæggende aspekter af biologi. Denne protokol beskriver en høj opløsning i vitro assay for at karakterisere tRNA ændring aktivitet af Mod5.
Denne protokol har den klar fordel af at give en direkte, og let fortolkelige udlæsning af isopentenylation….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dr. David Engelke til hans vejledning og nyttige kommentarer på dette håndskrift. PJS – Ball State University laboratorium start midler; DAB – give 1R15AI130950-01.
Materials
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).
- Soll, D. Enzymatic modification of transfer RNA. Science. 173 (3994), 293-299 (1971).
- Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).
- Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).
- Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).
- Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22 (5), 729-742 (2016).
- Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. 생화학. 39 (21), 6546-6553 (2000).
- Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).
- Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. 유전학. 159 (1), 147-157 (2001).
- Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).
- Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).
- Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).
- Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).
- Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).
- Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556 (1), 13-18 (2015).
- Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).
- Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3′ untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
- Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).
- Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).
- Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).
- Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients’ survival. Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).
- Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).
- Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. 생화학. 40 (6), 1734-1740 (2001).
- Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).
- Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).
- Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).
- Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18 (1), 11-26 (1979).
- Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).
- Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
- Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3′ UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159 (1), 148-162 (2014).
- Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).
- Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).
