कीटनाशक प्रतिरोधी घर मक्खियों में Carboxylesterases के कार्यात्मक लक्षण वर्णन, Musca Domestica
Summary
यहां, हम एक baculovirus मध्यस्थता कीट सेल अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ इन विट्रो में घर मक्खी carboxylesterase प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है और बाद में कार्यात्मक metabolizing permethrin में अपनी भूमिकाओं को चिह्नित, जिससे, pyrethroid को प्रदान सेल का आयोजन MTT परख और इन विट्रो चयापचय अध्ययन पर आधारित द्वारा प्रतिरोध ।
Abstract
Carboxylesterase-मध्यस्थता चयापचय विभिंन कीड़ों में कीटनाशक प्रतिरोध में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए सोचा है । कई carboxylesterase जीन पाया गया प्रतिरोधी घर मक्खी तनाव में विनियमित, जबकि कीटनाशक प्रतिरोध प्रदान करने में उनकी भूमिका का पता लगाया जा रहे थे । यहां, हम carboxylesterases के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल बनाया । तीन उदाहरण प्रयोग प्रस्तुत हैं: (1) एक baculovirus मध्यस्थता कीट धब् frugiperda (Sf9) कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली के माध्यम से carboxylesterase प्रोटीन की अभिव्यक्ति और अलगाव; (२) एक कोशिका आधारित MTT (३-[४, ५-dimethykthiazol-२-yl]-२, ५-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड) cytotoxicity परख कर कीट कोशिकाओं की सहनशीलता को मापने के लिए विभिन्न permethrin उपचार; और (3) इन विट्रो में चयापचय अध्ययन permethrin की ओर carboxylesterases की चयापचय क्षमताओं का पता लगाने के लिए. carboxylesterase जीन MdαE7 एक प्रतिरोधी घर मक्खी तनाव ALHF से क्लोन और baculovirus कोशिकाओं के संक्रमण के लिए एक रिकॉमबिनेंट Sf9 का निर्माण किया गया था । अलग permethrin उपचार के खिलाफ सेल viabilities MTT परख के साथ मापा गया । प्रयोगात्मक समूह की बढ़ी हुई कोशिका सहिष्णुता (MdαE7-रिकॉमबिनेंट baculovirus संक्रमित कोशिकाओं) नियंत्रण समूहों के उन लोगों के साथ तुलना में (बिल्ली-रिकॉमबिनेंट baculovirus संक्रमित कोशिकाओं और GFP-रिकॉमबिनेंट baculovirus संक्रमित कोशिकाओं) के लिए permethrin उपचार metabolizing कीटनाशकों में MdαE7 की क्षमताओं का सुझाव दिया, जिससे रासायनिक नुकसान से कोशिकाओं की रक्षा । इसके अलावा, carboxylesterase प्रोटीन कीट Sf9 कोशिकाओं में व्यक्त किए गए और अलग करने के लिए एक इन विट्रो चयापचय अध्ययन आचरण । हमारे परिणामों को इन विट्रो में एक महत्वपूर्ण संकेत permethrin की ओर MdαE7 की चयापचय दक्षता, सीधे metabolizing कीटनाशकों में carboxylesterases की भागीदारी का संकेत है और इस तरह घर मक्खियों में कीटनाशक प्रतिरोध प्रदान करते हैं ।
Introduction
कीटनाशक प्रतिरोध वर्तमान में घर मक्खी नियंत्रण दुनिया भर में1,2का एक प्रमुख मुद्दा है । कीटनाशक प्रतिरोध के तंत्र का निर्धारण करने के प्रयास इस मुद्दे की बेहतर समझ की सुविधा है और इस तरह उपंयास रणनीतियों को प्रभावी ढंग से रोकने या प्रतिरोध विकास3के प्रसार को कम करने प्रदान करते हैं । Carboxylesterases, प्रमुख detoxification एंजाइमों में से एक के रूप में, sequestering और विभिंन कीड़ों में metabolizing कीटनाशकों में अपनी भूमिकाओं के लिए ध्यान की एक बहुत आकर्षित किया है4,5,6। हमारे पिछले अध्ययन घर मक्खियों में कई carboxylesterases की पहचान की है और उनकी अभिव्यक्ति के स्तर पर ही constitutively-प्रतिरोधी ALHF तनाव में विनियमित नहीं थे, लेकिन यह भी permethrin उपचार के जवाब में उच्च स्तर के लिए प्रेरित किया जा सकता है7 . हालांकि, metabolizing कीटनाशकों में इन carboxylesterase जीन के कार्यात्मक characterizations का पता लगाया जाना बाकी है.
1980 के दशक में पहली रिपोर्ट के बाद से8, एक baculovirus मध्यस्थता विदेशी जीन अभिव्यक्ति प्रणाली व्यापक रूप से अपने उच्च प्रोटीन उत्पादन दक्षता और eukaryotic प्रोटीन प्रसंस्करण क्षमताओं9के कारण कार्यरत किया गया है । यह द्विआधारी प्रणाली दो आवश्यक तत्वों से बना है: निर्माण रिकॉमबिनेंट मेजबान कोशिकाओं में विदेशी जीन देने baculovirus, और रिकॉमबिनेंट baculovirus द्वारा संक्रमित कोशिकाओं द्वारा रुचि प्रोटीन के बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति । पिछले कुछ दशकों में, baculovirus मध्यस्थता सेल अभिव्यक्ति प्रणाली व्यापक रूप से रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के हजारों का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, cytosolic एंजाइमों से झिल्ली को लेकर कीट और स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन बंधे10. हमारे पिछले अध्ययन सफलतापूर्वक इस प्रणाली11के साथ कीट Sf9 कोशिकाओं में एकाधिक CYP450 एंजाइमों व्यक्त किया है । इस अध्ययन में, हम एक carboxylesterase-रिकॉमबिनेंट baculovirus का निर्माण कीट Sf9 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए, अलग permethrin उपचार के लिए सेल सहिष्णुता का पता लगाया, और कार्यात्मक के लिए इन विट्रो में बड़े पैमाने पर व्यक्त carboxylesterase प्रोटीन अन्वेषण. इसके बजाय पिछले अध्ययनों द्वारा अपनाया के रूप में कीट homogenates से कई carboxylesterase isozyme मिश्रण की जांच के12,13, इस baculovirus-मध्यस्थता कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली विशिष्ट अभिव्यक्ति की अनुमति देता है और उनके जैव रासायनिक और संरचनात्मक गुणों के बेहतर लक्षण वर्णन के लिए लक्षित प्रोटीन का अलगाव ।
tetrazolium नमक आधारित परख (MTT) एक उच्च प्रवाह वर्णमिति विधि विकसित और कोशिका व्यवहार्यता को मापने के लिए अनुकूलित है । यह परख तंत्र है कि केवल जीवित कोशिकाओं metabolizing में सक्षम है पर आधारित है पीले रंग का एक काला बैंगनी रंग formazan हाला, जो colorimetrically किया जा सकता है कार्बनिक सॉल्वैंट्स14में भंग के बाद विश्लेषण के लिए MTT एजेंट, 15. कई और अधिक सटीक लेकिन समय लेने वाले तरीकों, जैसे Trypan नीले अपवर्जन और thymidine अनुमापन परख16,17, हाल के वर्षों में विकसित किया गया है । हालांकि, सेल आधारित MTT परख अभी भी वर्तमान में सबसे तेजी से और आसानी से संचालित विधि के रूप में मांयता प्राप्त करने के लिए जल्दी सेल व्यवहार्यता का पता लगाने । यहां, हम कीटनाशक उपचार के खिलाफ सेल सहिष्णुता का पता लगाने के लिए MTT परख का उपयोग करें । कोशिकाओं की बढ़ी हुई सहनशीलता जब carboxylesterase रिकॉमबिनेंट से संक्रमित baculovirus दृढ़ता से कीटनाशकों, जो बारी में कीटनाशक प्रतिरोध में उनकी भागीदारी का पता चलता है के लिए carboxylesterases की चयापचय भूमिकाओं का समर्थन करता है ।
इसके अतिरिक्त, एक इन विट्रो चयापचय परख भी इस अध्ययन में आयोजित किया गया था । सामान्य carboxylesterase परख है कि α-napthyl एसीटेट (α-na) और β-naphthyl एसीटेट (β-na) hydrolytic की carboxylesterases गतिविधियों को प्रतिबिंबित करने के लिए जैसे आम सब्सट्रेट का उपयोग के साथ तुलना में, इन विट्रो चयापचय अध्ययन एक सही तरीका माना जाता है 18कीटनाशकों की ओर carboxylesterases की गतिविधियों को सीधे मापने के लिए । इस विधि सफलतापूर्वक कीटनाशक प्रतिरोध11,19,20के साथ सहयोग में एकाधिक cytochrome P450s की विशेषता के लिए विभिन्न कीड़ों में कार्यरत किया गया है । हालांकि carboxylesterase स्टडीज में इस पद्धति को अभी तक लागू नहीं किया गया है । carboxylesterase baculovirus द्वारा उत्पादित प्रोटीन की उपलब्धता के साथ-मध्यस्थता अभिव्यक्ति प्रणाली, हम एक इन विट्रो में प्रदर्शन कर सकते हैं carboxylesterases की ओर permethrin की चयापचय का अध्ययन, जो आगे की भागीदारी के मजबूत सबूत प्रदान कर सकते हैं घर मक्खियों में pyrethroid प्रतिरोध को carboxylesterases में ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हाल के दशकों में, heterologous अभिव्यक्ति प्रणालियों को व्यापक रूप से व्यक्त किया गया है और प्रोटीन की बड़ी मात्रा को अलग, इस प्रकार जैव रासायनिक और कार्यात्मक निर्धारण और इन विट्रो मेंएंजाइमों के लक्षण वर…
Materials
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs inc. | M0491L | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen by life technology | K240020 | S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit. |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen by life technology | K210002 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits | Invitrogen by life technology | 11791-023 | |
| BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit | Invitrogen by life technology | 12562-019 | Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit |
| pENTR-CAT plasmid | Invitrogen by life technology | Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified | Gibco by Life Technologies | 10082-139 | |
| Sf9 cells in Sf-900 III SFM | Gibco by Life Technologies | 12659017 | |
| Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer | G Biosciences by A Geno Technology Inc | 786-411 | |
| Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete | Gibco by Life Technologies | 12658-019 | |
| Grace's Insect Medium, unsupplemented | Gibco by Life Technologies | 11595030 | |
| Permethrin (isomers) analytical standard | SUPELCO by Solutions WithinTM | 442748 | |
| Methanol (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Acetonitrile (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) | Pall Life Sciences | 21890388 | |
| Alliance Waters 2695 HPLC System | Waters | ||
| T100 Thermal Cycle | Bio-Rad Laboratories Inc. | 1861096 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek |
References
- Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
- Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803 (2013).
- Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
- Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771 (2015).
- Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).
- Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
- Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
- Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7 (1), 587 (2017).
- Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).
- Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
- Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. , 237-245 (2011).
- Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, &. #. 1. 9. 3. ;. MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. , (2013).
- Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).
- Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
- Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).
- Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. , 15-21 (2002).
- Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211 (2006).
- Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
