Caratterizzazione funzionale di Carboxylesterases in casa resistente all'insetticida mosche, Musca Domestica
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per produrre casa volare carbossilesterasi proteine in vitro con un sistema di espressione di baculovirus mediata delle cellule di insetto e successivamente funzionalmente caratterizzano i loro ruoli in che metabolizza permetrina, quindi, che conferisce piretroidi resistenza conducendo basati su cellule MTT assay e in vitro gli studi metabolici.
Abstract
Il metabolismo mediato carbossilesterasi è pensato per svolgere un ruolo importante nella resistenza agli insetticidi in vari insetti. Diversi carbossilesterasi geni sono stati trovati up-regolato nel ceppo resistente casa volare, mentre loro ruoli che conferiscono resistenza agli insetticidi è rimasto per essere esplorato. Qui, abbiamo progettato un protocollo per la caratterizzazione funzionale di carboxylesterases. Vengono presentati tre esperimenti di esempio: (1) espressione e l’isolamento delle proteine carbossilesterasi attraverso un insetto baculovirus-mediata Spodoptera frugiperda (Sf9) sistema di espressione delle cellule; (2) un MTT basati su cellule (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-dimethylthiazolyl bromuro) analisi di citotossicità per misurare la tolleranza delle cellule di insetto a permetrina diversi trattamenti; e (3) in vitro gli studi metabolici per esplorare la capacità metabolica di carboxylesterases verso permetrina. Il gene carbossilesterasi MdαE7 è stato clonato da una casa resistente volare ceppo ALHF e utilizzato per costruire un baculovirus ricombinanti per l’infezione di cellule Sf9. La viabilità cellulare contro permetrina diversi trattamenti sono stati misurati con l’analisi di MTT. La tolleranza cellulare avanzata del gruppo sperimentale (cellule di baculovirus infettati MdαE7-ricombinante) rispetto a quelli dei gruppi di controllo (CAT-ricombinante baculovirus infettato cellule e le cellule di baculovirus infettati GFP-ricombinante) a permetrina trattamenti suggerito le funzionalità del MdαE7 nel metabolismo insetticidi, proteggendo le cellule dai danni chimici. Oltre a questo, carbossilesterasi proteine sono stati espressi in cellule di insetto Sf9 e isolati per condurre uno studio metabolico in vitro . I nostri risultati hanno indicato una significativa in vitro efficienza metabolica di MdαE7 verso permetrina, direttamente che indica il coinvolgimento di carboxylesterases nel metabolismo insetticidi e conferendo resistenza agli insetticidi in casa mosche.
Introduction
Resistenza agli insetticidi è attualmente un problema importante di casa controllo della Mosca in tutto il mondo1,2. Gli sforzi per determinare il meccanismo della resistenza agli insetticidi facilita la comprensione di questo problema e quindi fornire nuove strategie per efficacemente prevenire o ridurre al minimo la diffusione di resistenza sviluppo3. Carboxylesterases, come uno degli enzimi più importanti di disintossicazione, hanno attirato molta attenzione per i loro ruoli in sequestranti e metabolizzare gli insetticidi in vari insetti4,5,6. Il nostro studio precedente ha identificato più carboxylesterases in casa mosche e loro livelli di espressione non erano solo costitutivamente up-regolato nel ceppo resistente ALHF ma possono anche essere indotta a più alti livelli in risposta ai trattamenti di permetrina7 . Tuttavia, le caratterizzazioni funzionali di questi geni carbossilesterasi nel metabolismo insetticidi rimangono per essere esplorato.
Dal primo rapporto nei primi anni 19808, un sistema di espressione di baculovirus-mediata del gene straniero è stato ampiamente impiegato grazie alla sua efficienza di produzione ad alta percentuale proteica e la proteina eucariotica elaborazione capacità9. Questo sistema binario è composto da due elementi essenziali: il baculovirus ricombinanti costruito offrendo geni estranei in cellule dell’ospite e l’espressione su larga scala di proteine interessate da cellule infettate da baculovirus ricombinanti. Negli ultimi decenni, il sistema di espressione di baculovirus mediata delle cellule è stato ampiamente utilizzato per produrre migliaia di proteine ricombinanti, che vanno da enzimi citosolici alle proteine di membrana-limitano in insetto e cellule di mammifero10. Il nostro studio precedente ha correttamente espresso più enzimi CYP450 in cellule di insetto Sf9 con questo sistema11. In questo studio, abbiamo costruito un baculovirus carbossilesterasi-ricombinante per infettare cellule di insetto Sf9, esplorato la tolleranza delle cellule a permetrina diversi trattamenti e su larga scala carbossilesterasi espresse proteine in vitro per funzionale esplorazione. Invece di indagare più miscele di isozima carbossilesterasi da insetto omogeneati adottata dal precedente studi12,13, questo sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto permette l’espressione specifica e isolamento di proteine mirati per la migliore caratterizzazione delle loro proprietà biochimiche e strutturali.
Base di sale tetrazolio (MTT) è un metodo colorimetrico di alto-rendimento sviluppato e ottimizzato per misurare la vitalità cellulare. Questa analisi è basata sul meccanismo che solo le cellule viventi sono in grado di metabolizzare il reagente MTT di colore giallo di un precipitato di formazan colorato viola scuro, che può essere analizzato colorimetricamente dopo dissolto in solventi organici14, 15. Molti più accurata, ma metodi che richiede tempo, come esclusione in Trypan blue e la timidina titolazione dosaggio16,17, sono stati sviluppati negli ultimi anni. Tuttavia, l’analisi di MTT basati su cellule è ancora attualmente riconosciuto come il metodo più rapido e facilmente azionabile per rilevare rapidamente la vitalità cellulare. Qui, usiamo l’analisi di MTT per esplorare la tolleranza delle cellule contro trattamenti insetticidi. La maggiore tolleranza delle cellule quando infettati con baculovirus ricombinanti carbossilesterasi fortemente supporta i ruoli metabolici di carboxylesterases agli insetticidi, che a sua volta suggerisce loro coinvolgimento nella resistenza agli insetticidi.
Inoltre, un’analisi metabolica in vitro è stata anche condotta in questo studio. Rispetto generale carbossilesterasi saggi che utilizzano substrati comuni come acetato di α-napthyl (α-NA) e β-naftil acetato (β-NA) per riflettere l’attività idrolitica di carboxylesterases, lo studio metabolico in vitro è considerato come un modo accurato misurare direttamente attività di carboxylesterases verso insetticidi18. Questo metodo è stato impiegato con successo in vari insetti per caratterizzare più citocromo P450s in associazione con insetticida resistenza11,19,20. Tuttavia, questo metodo non è stato ancora applicato negli studi carbossilesterasi. Con la disponibilità di carbossilesterasi proteine prodotte dal sistema di espressione di baculovirus-mediata, possiamo eseguire uno studio metabolico in vitro di carboxylesterases verso permetrina, in grado di fornire ulteriore forte evidenza del coinvolgimento di carboxylesterases nel conferire resistenza piretroide in casa mosche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi decenni, i sistemi di espressione eterologhi sono stati ampiamente usati per esprimere e isolare grandi quantità di proteine, permettendo la determinazione biochimica e funzionale e caratterizzazione di enzimi in vitro. Ad oggi, diversi sistemi di modello diverso tra cui Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaee Spodoptera frugiperda sono stati adattati per espressione recombinant della proteina e la scelta della sistema in vitro è c…
Materials
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs inc. | M0491L | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen by life technology | K240020 | S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit. |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen by life technology | K210002 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits | Invitrogen by life technology | 11791-023 | |
| BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit | Invitrogen by life technology | 12562-019 | Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit |
| pENTR-CAT plasmid | Invitrogen by life technology | Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified | Gibco by Life Technologies | 10082-139 | |
| Sf9 cells in Sf-900 III SFM | Gibco by Life Technologies | 12659017 | |
| Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer | G Biosciences by A Geno Technology Inc | 786-411 | |
| Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete | Gibco by Life Technologies | 12658-019 | |
| Grace's Insect Medium, unsupplemented | Gibco by Life Technologies | 11595030 | |
| Permethrin (isomers) analytical standard | SUPELCO by Solutions WithinTM | 442748 | |
| Methanol (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Acetonitrile (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) | Pall Life Sciences | 21890388 | |
| Alliance Waters 2695 HPLC System | Waters | ||
| T100 Thermal Cycle | Bio-Rad Laboratories Inc. | 1861096 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek |
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