Caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases chez les mouches maison résistant aux insecticides, Musca Domestica
Summary
Nous présentons ici un protocole pour produire chambre carboxylestérase mouche protéines in vitro avec un système d’expression baculovirus médiée par cellule insectes et plus tard fonctionnellement caractériser leurs rôles en métabolisant perméthrine, ainsi, conférant aux pyréthrinoïdes résistance en procédant à base de cellules MTT dosage et in vitro études métaboliques.
Abstract
Métabolisme médié par la carboxylestérase est censé jouer un rôle majeur dans la résistance aux insecticides chez les insectes divers. Plusieurs gènes de la carboxylestérase trouvées régulée dans la souche mouche résistant à la maison, tandis que leurs rôles en conférant la résistance aux insecticides restaient à explorer. Ici, nous avons conçu un protocole de caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases. Trois expériences d’exemple sont présentés : (1) expression et l’isolement des protéines carboxylestérase grâce à un insecte médiée par les baculovirus Spodoptera frugiperda (Sf9) système d’expression cellulaire ; (2) un MTT à base de cellules (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromure) test de cytotoxicité pour mesurer la tolérance des cellules d’insectes à la perméthrine différents traitements ; et (3) in vitro études métaboliques d’explorer les capacités métaboliques des carboxylestérases vers la perméthrine. Le gène de la carboxylestérase MdαE7 a été cloné à partir d’une maison résistante voler souche ALHF et utilisé pour construire un baculovirus recombinant pour l’infection de cellules Sf9. La viabilité cellulaire contre perméthrine différents traitements ont été mesurée avec le test MTT. La tolérance des lymphocytes améliorés du groupe expérimental (cellules de baculovirus infectés MdαE7 recombinant) comparé à ceux des groupes témoins (cellules infectées de baculovirus recombinant CAT et cellules infectées de baculovirus recombinant GFP) de perméthrine traitements a suggéré les fonctionnalités de MdαE7 dans le métabolisme des insecticides, protégeant ainsi les cellules des dommages chimiques. En outre, carboxylestérase protéines étaient exprimées dans des cellules d’insecte Sf9 et isolés pour mener une étude métabolique in vitro . Nos résultats ont indiqué une significative in vitro l’efficacité métabolique de MdαE7 vers la perméthrine, directement indiquant l’implication des carboxylestérases en métabolisant les insecticides et conférant ainsi la résistance aux insecticides dans la maison d’oiseau.
Introduction
Résistance aux insecticides est actuellement un enjeu majeur du contrôle de la mouche de maison dans le monde1,2. Efforts pour déterminer que le mécanisme de résistance aux insecticides permet de mieux comprendre cette question et de fournir ainsi des stratégies novatrices pour efficacement prévenir ou limiter la propagation de la résistance développement3. Carboxylestérases, comme l’une des enzymes de détoxication importants, ont attiré beaucoup d’attention pour leur rôle dans la séquestration et métabolisant les insecticides chez divers insectes4,5,6. Notre étude précédente a identifié plusieurs carboxylestérases en mouches domestiques et leurs niveaux d’expression était non seulement constitutivement régulée dans la souche résistante de ALHF mais peut également être induite à la hausse des niveaux en réponse aux traitements de perméthrine7 . Toutefois, la caractérisation fonctionnelle de ces gènes carboxylestérase dans le métabolisme des insecticides reste à explorer.
Depuis le premier rapport au début des années 19808, un système d’expression de gènes étrangers baculovirus a été largement employé en raison de son efficacité de production riche en protéines et protéines eucaryotes traitement capacités9. Ce système binaire est composé de deux éléments essentiels : le baculovirus recombinant construit des gènes étrangers dans les cellules de l’hôte et l’expression à grande échelle des protéines intéressées par les cellules infectées par des baculovirus recombinant. Ces dernières décennies, le système d’expression baculovirus médié cellulaire a été largement utilisé pour produire des milliers de protéines recombinantes, allant des enzymes cytosoliques aux protéines membranaires chez insecte et10des cellules mammifères. Notre étude précédente a exprimé avec succès plusieurs enzymes CYP450 dans des cellules d’insecte Sf9 avec ce système11. Dans cette étude, nous avons construit un baculovirus recombinant carboxylestérase pour infecter des cellules d’insecte Sf9, explore la tolérance des lymphocytes de perméthrine différents traitements et à grande échelle exprimée carboxylestérase protéines in vitro pour fonctionnelle exploration. Au lieu d’enquêter sur des mélanges d’isozymes carboxylestérase multiples d’homogénats insectes tel qu’adopté par les précédentes études12,13, ce système d’expression baculovirus insectes cellulaire permet l’expression spécifique et isolement des protéines ciblées pour une meilleure caractérisation de leurs propriétés biochimiques et structurales.
Le test de base de sels de tétrazolium (MTT) est une méthode colorimétrique de haut débit développé et optimisé pour mesurer la viabilité des cellules. Cette analyse est basée sur le mécanisme que seulement les cellules vivantes sont capables de métaboliser le réactif MTT de couleur jaune à un précipité de formazan couleur violet foncé, qui peut être analysé par colorimétrie après dissous dans des solvants organiques14, 15. Plusieurs plus précis mais les méthodes fastidieuses, telles que le bleu Trypan exclusion et la thymidine titrage dosage16,17, ont été développés ces dernières années. Cependant, le test MTT basés sur les cellules est encore actuellement reconnu comme la méthode la plus rapide et plus facilement exploités pour détecter rapidement la viabilité cellulaire. Ici, nous utilisons le test MTT pour explorer la tolérance des lymphocytes contre des traitements insecticides. La tolérance accrue des cellules lorsqu’elles sont infectées par la carboxylestérase baculovirus recombinant fortement prend en charge les rôles métaboliques des carboxylestérases aux insecticides, qui suggère à son tour leur implication dans la résistance aux insecticides.
En outre, un essai in vitro métabolique avec a été également menée dans cette étude. Par rapport aux dosages carboxylestérase générales qui utilisent des substrats communs tels que α-naphtyl acétate (α-NA) et β-naphtyl acétate (β-NA) afin de tenir compte des activités hydrolytiques des carboxylestérases, l’étude métabolique in vitro est considéré comme un moyen précis de mesurer directement les activités des carboxylestérases vers insecticides18. Cette méthode a été utilisée avec succès dans divers insectes, pour caractériser plusieurs cytochrome P450s en liaison avec l’insecticide résistance11,19,20. Toutefois, cette méthode n’a pas encore été appliquée dans les études de la carboxylestérase. Avec la disponibilité de la carboxylestérase protéines produites par le système d’expression baculovirus-négociée, nous pouvons effectuer une étude métabolique in vitro des carboxylestérases vers permethrin, qui peut fournir plus de preuves solides de l’implication des carboxylestérases en conférant une résistance aux pyréthrinoïdes dans la maison d’oiseau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ces dernières décennies, des systèmes d’expression hétérologue ont été employé couramment pour exprimer et isoler les grandes quantités de protéines, ce qui permet la détermination biochimique et fonctionnelle et la caractérisation des enzymes in vitro. A ce jour, plusieurs systèmes de modèles différents dont Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaeet Spodoptera frugiperda ont été adaptés pour l’expression de protéine recombinante et …
Materials
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs inc. | M0491L | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen by life technology | K240020 | S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit. |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen by life technology | K210002 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits | Invitrogen by life technology | 11791-023 | |
| BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit | Invitrogen by life technology | 12562-019 | Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit |
| pENTR-CAT plasmid | Invitrogen by life technology | Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified | Gibco by Life Technologies | 10082-139 | |
| Sf9 cells in Sf-900 III SFM | Gibco by Life Technologies | 12659017 | |
| Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer | G Biosciences by A Geno Technology Inc | 786-411 | |
| Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete | Gibco by Life Technologies | 12658-019 | |
| Grace's Insect Medium, unsupplemented | Gibco by Life Technologies | 11595030 | |
| Permethrin (isomers) analytical standard | SUPELCO by Solutions WithinTM | 442748 | |
| Methanol (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Acetonitrile (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) | Pall Life Sciences | 21890388 | |
| Alliance Waters 2695 HPLC System | Waters | ||
| T100 Thermal Cycle | Bio-Rad Laboratories Inc. | 1861096 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek |
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